胰島素親和層析實驗

部分純化的胰島素受體 NaCl 胰島素瓊脂糖 溶液 F 溶液 G 溶液 H

一次性小型塑料柱 CentriconTM 濃縮器 銀染試劑盒

材料與設備

部分純化的胰島素受體，得自 WGA-瓊脂糖柱層析（見本單元實驗 3)

NaCl(5mol/L)

胰島素瓊脂糖（~2 ml 預裝膠）（SigmaChemicalCo-)

一次性小型塑料柱（Bio-Rad Laboratories)

Centricon^TM 濃縮器（Amicon，Inc.)

銀染試劑盒（Bio-Rad Laboratories 161-0449)

試劑

溶液 F

溶液 G

溶液 H

(配方，見 試劑的配制，pp.234~240)

操作程序

1) 加 0.75 ml 5mol/L NaCl 于經 WGA-瓊脂糖柱部分純化的胰島素受體溶液（~3 ml) 中，調溶液 NaCl 濃度為 1mol/L。

2) 用 40 ml 溶液 F 沖洗胰島素瓊脂糖，去除可能影響固定化步驟的所有未偶聯的胰島素。

3) 將步驟 1 所得的混合液與胰島素瓊脂糖（每毫升受體溶液加 0.5 ml 胰島素瓊脂糖）混合，4℃ 孵育 18 h。

4) 待瓊脂糖達到室溫后，將其注入一次性小型塑料柱。室溫下用 15 ml 溶液 F 洗柱。

5) 用 10 ml 溶液 G 洗脫胰島素受體。分部收集 1ml 組分。

6) 用本單元實驗 2(見 P.212) 所述的胰島素結合試驗法鑒定含胰島素受體的組分。

7) 合并有胰島素結合活性的組分，并用 Centricon 濃縮器濃縮之。這可除去許多水份和去垢劑（辛基β-葡糖苷的膠束大小約為 8000Da)。

8) 與等體積的溶液 H 混合，將 Triton X-100 重新加入濃縮的受體溶液。為得到高親和性胰島素結合活性和高的胰島素刺激自磷酸化活性，有必要用 Triton X-100 替代辛基β-葡糖苷（Ridge 等，1988)。

9) 為證實所得產物確為胰島素受體及其純度，用 7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定所分離蛋白的大小（見附錄 5)。每孔加約 50ul 樣品，其中一孔為分子量標準。電泳后，用銀染試劑盒（silver stain plus kit) 對凝膠進行銀染。