用于外源蛋白質生產的細菌表達系統

一、使用大腸桿菌生產外源蛋白

有越來越多的細菌表達系統可用于外源蛋白的生產。影響選擇某個表達系統的因素包括目標蛋白質的天然性質、使用者的經驗及產品的預期用途。大腸桿菌是表達外源蛋白最常用的細菌表達系統。經過對大腸桿菌一個多世紀的廣泛研究，在調控機制和可能影響表達結果的宿主輔助蛋白的功能方面，研究人員已經獲得了大量的信息。此外，實驗室和商業蛋白質生產所需的方法和技術有著廣泛的來源。對許多蛋白質制備項目來說，這些可用的資源和極低的技術要求使得大腸桿菌成為初步進行蛋白質表達與篩選的首選宿主。因此，我們將用大腸桿菌作為模型，介紹蛋白質生產的具體方法和技術。在介紹使用大腸桿菌進行蛋白質表達的具體技術之后，我們還將探討其他可用的細菌表達系統。

在此介紹的許多使用大腸桿菌進行蛋白質生產的核心概念和技術可以直接應用于其他細菌表達系統。

二、設計一個細菌表達方案

細菌表達系統的成功運用依賴于表 12.1 中以時間順序列出的一系列有序的步驟。

蛋白質生產的起始階段不是開始實驗，而是明確對方案的整套要求以及對表達目標的序列特征和生化特性進行分析。這些步驟對方案的最終成功是很關鍵的，而且有助于對項目成本和成功可能性進行實際評估。為了與實驗部分保持連續性，我們對這些步驟進行了簡短的介紹，因為在本章的各節中都有對它們更為詳細的闡述。

三、方案需求的評估

表達產物的預期用途對于表達系統的選擇和決定其優先次序是很重要的。對于某些應用 (如功能解析或藥物篩選) 來說，保持蛋白的天然功能和特性是必需的; 但如果是當成免疫原來使用則關系不大。其他需要實際考慮的因素包括蛋白質產量、時間限制或生產成本。明確項目需求對于確保選擇合適的表達系統、克隆策略和所需產品的生產策略是至關重要的 (Dieckmanetal.，2006)。

四、目標蛋白質的分析

目標蛋白質的生化和生物學特性對于選擇表達策略來說是必須要考慮的，可以通過它們對表達結果和產物的可溶性做出初步預測。通過分析一級序列可以整合一組屬性用以預測二級結構、生物學定位 (細胞膜、細胞質、周質腔或胞外）、家族歸類 (折疊和結構域) 及推斷生化性質 (等電點、無序區域、配基)。目標蛋白質的一些特征，如極可能存在的跨膜螺旋，可能要求必須使用為表達膜蛋白設計的系統，或需要使用克隆單個結構域的策略以表達蛋白質的可溶部分。使用目標蛋白質的特征來指導表達宿主的選擇和載體的構建有助于獲得成熟的、定位適當的蛋白質。可以使用目標蛋白質或同源蛋白質的實驗數據和歷史數據對序列信息加以補充，從而有助于表達系統的進一步優化。例如，已知某蛋白質需要某種輔基以保持正確的功目旨，那就必須選擇特定的宿主以確保獲得具有完整功能的表達產物。一個恰當的例子是: 細胞色素 c 的表達受益于表達輔助蛋白的基因工程大腸桿菌的使用，該輔助蛋白能將血紅素共價連接至細胞色素前體的多肽鏈（Londeretal.,2008)。實際上, 在缺少目標蛋白質或相似蛋白質歷史表達數據的情況下，要預測某個蛋白質表達實驗的結果是非常困難的。通常的做法是使用數個表達系統, 一開始使用最簡單的、性價比最高的表達系統，失敗后再使用更復雜的表達系統。

五、克隆

目標序列的克隆有多種選擇，通常可將其分為串聯系統和并聯系統。串聯系統使用廣泛，為構建表達載體提供了多種生成目標序列/載體匹配末端的方法，如那些利用限制性內切核酸酶生成目標序列/載體匹配末端的方法。該方法的缺點是對每一個目標序列和載體都需要對限制性內切核酸酶的切割策略加以驗證。研究者們對平行系統，或者稱為普遍克隆技術的興趣日漸濃厚，該方法可以很容易地將目的片段轉移至多種載體和表達系統而無需考慮目的片段的序列（表 12.2)。這種系統的實例包括 Gateway(EspositoetaL，20 〇 9)、Infusion(Zhuetal.，2007) 及不依賴連接的克隆技術（ligationindependentcloning，LIC)(AslanidisanddeJong，1990;Haunetal.，1992)。該方法的優點是能夠將一個目的片段克隆至多個不同的載體中, 可以用經濟高效的方式同時評估多個表達策略。

LIC 是一種經濟高效且特別適合細菌表達系統的技術，因為克隆所用的試劑未ZL化, 且有數家供應商提供相關產品。在 LIC 技術中，特異的核苷酸序列被加至 PCR 引物，這允許克隆任何基因而不需考慮 DNA 的序列。在一種特殊的核苷三磷酸的參與下，通過 T4DNA 聚合酶的處理即可以獲得具有匹配末端的載體和 PCR 片段。這一處理可以在載體和 PCR 片段上產生 10~15bp 序列互補的單鏈突出，這些互補的單鏈突出退火后具有足夠的強度，不需要連接就可用于轉化。該方法允許 PCR 引物的設計具有一致性，有方向性，能夠獲得髙的克隆效率。雖然有商業化的載體可供使用，但該方法已被用于數個大規模的克隆項目，這些項目可以向個別研究者提供載體資源。下面介紹的操作流程是為了使用中西部結構基因組中心（MidwestCenterforStructuralGenomics) 設計的一套載體而開發的 (Eschenfeldtetal.，2009)。只要對添加至擴增引物上的特異序列加以調整，這項技術通常也適用于其他與 LIC 兼容的系統。

六、制備 T4 DNA 聚合酶處理的 DNA 片段

1.在目標序列特異的 PCR 引物上添加合適的 LIC 特異核苷酸序列（如正向引物:TACTTCCAATCCAATGCC; 添加終止密碼子的反向引物：TTATCCACTTCCAATGTTA)。

2.該方法可以經放大后使用微孔板進行 (96 個反應），但也可調整至任意數目的反應。混合以下試劑，準備足夠用于％ 孔板的 LIC 反應混合物。

① 465uL 10 X T4 DNA 聚合酶緩沖液。大部分經銷商提供的 T4 DNA 聚合酶緩沖液都可取代本部分介紹的 LIC 反應緩沖液。我們經過比較發現，不同的普通 T4 DNA 聚合酶緩沖液對終產物的克隆效率造成的影響不超過 25%。

② 465uL 分子生物學級的 25 mmol/L dCTP(Promegacat.no.U1221)。

③ 228uL 100 mmol/LDTT(Clithiothreitol) 溶液（Novagencat.no.70099)。

④ 60ul 水。

⑤ 250 單位 T4 DNA 聚合酶 (LIC 品質，約 2.5U/uL，EMD Biosciences/Novagen)。

3.將混合物置于冰上，在使用前加入 T4 DNA 聚合酶。用移液器反復吹打幾次以使酶均勻分布于反應混合物中。

4.向聚丙烯 96 孔板中每孔加人 10.4uL LIC 反應混合物。

5.向 LIC 反應混合物中加入 30yLUO?100ng) 純化的 PCR 片段，用移液器反復吹打幾次以混勻。室溫孵育 30 min。使用多個片段與載體比例的研究表明，退火反應對于目標 DNA 片段的量的變動有著很大的容忍度。

6.在 75°C 加熱塊上孵育 20 min，以使 T4DNA 聚合酶失活。

7.在另一塊 96 孔板上, 將 1~2 ul T4 聚合酶處理過的 PCRLIC 片段和 4 斗 (20~50ng)T4 聚合酶處理過的 LIC 載體進行退火。

8.在室溫下孵育退火反應 5?10 min。

9.使用全部的退火反應體系轉化約 50 大腸桿菌感受態細胞, 并挑選出轉化的克隆（SambrookandRussell,2001)。

加熱后，將 LIC 平板儲存于 4°C 冰箱，至需要時再取出。LIC 相容載體的制備與上述過程相似，但需使用堿基互補的 dGTP(Eschenfeldtetal.，2009)。在此階段，所構建的載體可以通過序列分析進行鑒定，或者在完成表達和可溶性分析之后再進行鑒定。

七、大腸桿菌細胞質中的表達

大部分大腸桿菌表達載體都是設計用于胞內表達的。這些載體經過工程改造，具有不同的篩選標記 (selectablemarker)、細菌啟動子、質粒復制原點 (plasmidreplicationorigin)、定位信號 (localizationsignal) 及融合標簽 (表 12.2)。我們在此介紹的方法適用于 T7 啟動子（Novagen,pET 載體系列），其能夠過表達目標蛋白質，表達水平與大腸桿菌中豐度最高的天然蛋白質的水平相當（StudierandMoffatt,1986)。能夠表達 T7RNA 聚合酶的大腸桿菌菌株 [如 BL2KDE3)] 對于使用 pET 家族的載體表達蛋白是必需的。

這些菌株的變種能夠共表達稀有密碼子的 tRNA(Carstens，2003)、蛋白質折疊必需的共輔助因子 (BaneyxandPalumbo，2003) 或是在胞質內有助于二硫鍵形成和促進重組蛋白活性折疊的那些蛋白質（PrinzetaL，1997)。這里的方案總結了利用 IPTG 和可誘導系統表達目標蛋白質的過程。

八、大腸桿菌細胞質中目標蛋白質的表達

1.接種單克隆于 2 mL 含有合適抗生素的培養基中。所使用試管的體積至少是培養基體積的 5 倍以保證能充分通氣。

2.樣品在 37℃ 250 r/min 條件下培養至 OD600nm 達到 0.4~0.8。培養液變成云霧狀但不要完全變渾濁。通常 BL21(DE3) 菌體達到此狀態需要生長 3~4 h。

3.加入 20ul 100 mmol/L IPTG 至每個培養體系（1 mmol/L 的終濃度）。重新將誘導的培養物放回 37°C、250r/min 的細菌培養器，培養 4 h。經過 4 h 的誘導, 培養物會變得完全渾濁。

4.培養物在 37°C 誘導 3?8 h 后應該出現明顯的蛋白質表達。取出樣品并按下述方法進行分析。

蛋白質表達及可溶性的分析

確認目標蛋白質的表達通常涉及對蛋白質表達和蛋白質可溶性的評估，以及對預期蛋白質大小的定性確認。大部分用于外源蛋白質表達的大腸桿菌系統都可以產生出足夠水平的目標蛋白質來滿足采用變性凝膠電泳的方式分析蛋白質的表達/可溶性 (圖 12.1)。這一方法價格低廉，相對簡單, 且能很快得到結果。表達水平極低的或可溶性極低的蛋白質可能需要更加靈敏的檢測方法, 如免疫印跡法。

九、大腸桿菌中表達的外源蛋白質的分析

1.從每個樣品中取出 200uL 誘導物至干凈的微量離心管。14000IVmin 離心 Imin。菌體會形成致密的沉淀，同時出現澄清的上清液。剩余的培養物可用于目標蛋白的可溶性質分析，詳見本章 10.1 節。

2.倒掉或吸出無用的培養基, 小心保留菌體沉淀。加人 502XSDS 上樣染料, 反復吹打幾次以重懸菌體。

3.將樣品煮沸 5 min，在上樣前將樣品冷卻。對于一個 17 孔的 8 cm X 10 cm 的考馬斯亮藍染色的凝膠，5uL 樣品通常就足夠了。

蛋白質可溶性的分析

1.通過 3500r/min 離心 10 min, 使剩余的菌體培養物中的菌體形成沉淀。小心倒掉無用的培養基，用紙巾蘸干殘留的液體。

2.—80°C 冰凍沉淀。為所有的樣品準備足夠的裂解緩沖液 [終濃度:300 mmo/L NaCl、50 mmol/L Na2Po4、蛋白酶抑制劑混合物（proteaseinhibitorCocktail，Sigma)、120kU/mL 重組溶菌酶（rLysoZyme，Novagen) 和 25U,mL 核酸酶（Benzonase,Novagen)]。或者，可以用 Bugbuster(Novagen) 或 frPER(Pierce) 代替裂解緩沖液。按照試劑說明，使用適用于 2 mL 培養物的試劑。

3.取出冰凍的樣品，稍微解凍。每個樣品加入 I80 裂解緩沖液，蓋緊蓋子后渦旋振蕩以重懸沉淀。

4.將樣品重新置于一 80°C，5 min, 然后取出并于室溫孵育，直到冰完全溶解。再重復凍融一次。樣品會變得澄清或是依然保持渾池。

5.3500r/min，離心 10?15 min, 沉淀菌體碎片。

6.從每個樣品上部取出 50fxL 上清液, 小心不要帶出菌體碎片。

7.向上清液中加人 6 〇 fxL2XSDS 上樣染料, 煮沸 5 min。用變性凝膠電泳分析樣品。對于一個 17 孔的 8 cmX10 cm 的考馬斯亮藍染色的凝膠，5 卟樣品通常就足夠了。

8.(可選) 為了檢測菌體裂解物中的不溶部分，除去步驟 7 菌體裂解碎片中所有剩余的上清液。小心不要擾動或移走沉淀。

9.向沉淀中加入 300juLIXSDS 上樣染料，蓋緊蓋子后渦旋振蕩至沉淀完全重新懸浮。

10.煮沸樣品 5 min, 在上樣至 SDS-PAGE 凝膠前稍加冷卻。對于一個 17 孔的 8 cmX10 cm 的考馬斯亮藍染色的凝膠，3 樣品通常就足以觀察表達情況。

蛋白質表達結果的分析

在評估表達和可溶性時使用同樣的培養系統可以彌補表達水平的差異。在大腸桿菌中蛋白質表達率通常可以超過 80%，但蛋白質的可溶性是該系統的主要限制因素，它與目標蛋白質本身有關（圖 12.1)。經過 SDS~PAGE 分析，如果在正確的分子質量位置未檢測到目標蛋白質的染色條帶，那就可以認為其「不表達」或是「不可溶」。反之，則認為其可以「表達」或「可溶」。這屬于定性的評估，必須再進行序列分析和/或質譜分析以確認^肽的身份。我們采用了相對密度排序法，即將目標蛋白質的染色密度與大腸桿菌中天然蛋白質的通常染色密度相比。目的條帶可見，但其染色密度比大部分大腸桿菌蛋白質條帶的染色密度低，則記為 1 級水平或是低表達/低可溶性。2 級和 3 級水平（中等或高表達/高可溶性) 分別表示染色強度與大腸桿菌中高表達的蛋白質染色強度相當或更高。

蛋白質表達的自誘導方法

IPTG 誘導的一個缺點是需要監測細菌的生長以獲得最佳的誘導條件。這一缺點在檢測大批量克隆的表達時變得尤為突出。在這種情況下，可以觀察到生長速率的不同，從而很難獲得所有表達克隆的最佳誘導條件。自誘導系統為我們提供了克服這些困難的方法, 并且簡化了表達方案（Studier，2005)。目前已報道了數種自誘導系統, 它們可以利用 pET 和其他 IPTG 誘導的細菌表達系統來提供高水平的蛋白質表達 (Blotnmeletal.，2007)。

十、使用自誘導培養基方案的小量表達培養

十一、蛋白質的周質表達

細菌蛋白質組中有 8%?12% 的蛋白質不定位于胞質中。針對這部分蛋白質的外源表達策略包括: 擴增編碼區的非信號肽部分，利用胞質表達載體或周質表達載體，通過標準的大腸桿菌克隆和表達流程進行操作, 從而得到與胞質蛋白相似的表達結果。該方法也成功用于某些含有二硫鍵的真核蛋白。通過在目標蛋白質 N 端添加合適的定位信號 (如大腸桿菌的 PelB 信號序列），就可將蛋白質定位于大腸桿菌的周質空間。由于周質只占菌體總體積的 20%?40%，總的來說，周質表達的表達量一般低于胞質表達的。直接比較克隆至胞質表達載體的目標蛋白質 (圖 12.2, 目標蛋白質 4?6) 與克隆至周質表達載體的目標蛋白質 (圖 12.2, 目標蛋白質 10?12) 的表達水平，就可得出此結論。

十二、大腸桿菌周質腔中目標蛋白質的表達

1.接種單克隆于 2 mL 含有合適抗生素的培養基。所用試管的容納體積至少是培養液體積的 5 倍，以保證充分的通氣。

2.30°C、250r/min 條件下培養至 OD68jnm 達到〇.4?0.8。培養液應該變成云霧狀但不要完全變渾濁。通常 BL2KDE3) 菌體達到此狀態需要生長 3?5 h。

3.降低培養容器溫度至 19°C，孵育至少 30 min 以使菌體達到平衡。培養物的 OD 值在溫度轉換期間會繼續增加。

4.加人 20 斗 100 mmol/LIPTG 至每個培養體系 (終濃度為 Immol/L)。將培養體系放回培養容器，19°C、250r/min 過夜培養。經過誘導過夜，培養液會完全變渾濁。

5.培養物在 19°C 誘導 4 h 后就會有少量表達，12~16 h 后就會有明顯的表達。

十三、小規模滲透休克法

如果需要確認一個目標蛋白質定位于周質中，那么滲透休克法可用于分析與胞質組分分開的周質組分。有許多從細菌周質中釋放蛋白質的技術可供使用。加入三氯甲烷 (chloroform)(Amesetal.，1984) 或多黏菌素 B(polymyxinB)(DixonandChopra,1986) 可以從周質中釋放蛋白質。下面介紹的方法成本低廉，使用的是常用的實驗室試劑 (NeuandHeppeU1965;NossalandHeppeU1966)。將溶菌酶（lysozyme) 加人滲透休克 SETC 蔗糖、EDTA、Tris-HCl) 緩沖液中可以除去更多的菌體外壁和組分 (BirdsellandCota-Robles，1967;MalamyandHorecker，1964); 這一步產生的原生質體（spheroplast) 非常容易裂解，因此胞質蛋白可能會污染周質組分。對于易裂解的菌體，向冷水休克液中加入〇.5 mmol/L 的 MgCl2 可以穩定原生質體 (NeuandChou,1967)。我們介紹的方法對大部分耙向周質的蛋白質都適用，但對有些靶向周質的蛋白質可能需要優化。比較圖 12.3 中 SET 和水中目標蛋白質的量，可說明對不同蛋白質來說抽提結果是不同的。不過, 相比于背景宿主蛋白，可溶的外源蛋白富集在休克組分中（圖 12.3)。該方法可以放大，作為第一個純化步驟以減少背景蛋白質和菌體碎片。

十四、用于外源蛋白質生產的其他細菌系統

有許多不同的細菌表達系統可用于表達外源蛋白。許多時候，細菌表達系統的選擇通常是由目標蛋白質的特性決定的。盡管大腸桿菌可用于多血紅素細胞色素 (nmltihemecytochromes) 的外源表達，但通常會選擇另一種宿主來表達含多個血紅素基團的細胞色素復合物（complexcytochrome)。希瓦氏菌（S/iewaneWaonei<ie7m\s) 是一種革蘭氏陰性菌，通常用于生產這種特殊的蛋白質。該生物的基因組能編碼大量預測的細胞色素 c 基因，而且含有能促進細胞色素 c 被正確加工成為成熟蛋白的輔助蛋白（TakayamaandAkutsu，2007)。一個經過工程改造的突光假單胞菌（_Psewc?omonas/ZM 〇?-e?:e?w) 菌株 (Pfenex，DOWChemicalCa) 已經被開發為外源蛋白表達系統，用于大批量發酵和目標蛋白質的高通量小規模篩選。這一經過修飾的革蘭氏陰性菌具有多種代謝功能和微生物分泌系統，從而可以使表達產物位于胞質、周質或胞外空間。

利用非致病性革蘭氏陽性桿菌表達蛋白質為我們提供了革蘭氏陰性宿主菌之外的另一個選擇 (Schmidt,2004)。這些生物含有天然高效的分泌系統，可以直接將蛋白質表達于培養液上清液中，從而可以提高產量，同時便于純化。最常用的菌株是工程改造的枯草芽孢桿菌 (BadWws，其缺乏胞外脂肪水解酶 (lipolyticenzyme) 和蛋白酶的基因，從而提高了外源蛋白的穩定性。巨大芽抱桿菌 (BaciZZwsOTegaferiwm) 有數個大質粒，它以能夠穩定復制和保持這些質粒而聞名。其表達菌株通常具有較低的內在蛋白酶活性，還有一些特點組合在一起能夠獲得蛋白質的穩定高產。

膜蛋白在基因組編碼的蛋白質中占有相當的比例，但對于蛋白質表達來說仍然是個挑戰。除了大腸桿菌（NeophytouetaL,2007;ShawandMiroux,2003)，研究者們還開發了數個其他的膜蛋白表達系統來表達完整的膜蛋白。革蘭氏陽性的乳酸菌—乳酸乳球菌（LartococcwsZartt’s) 生長密度高，適于大規模的膜蛋白超量生產（Kunjietal.，2003)。有數個營養缺陷型菌株和多環乳酸鏈球菌素（polycyclicpeptidenisin) 調控的可誘導表達系統可以使用。用于膜蛋白鑒定的功能篩選可使用全菌進行，因為配基可以直接作用于表達在細胞膜上的膜蛋白。

經過工程改造，光合細菌紅細菌屬已用于全長膜蛋白的外源表達 (Laibleetal.，2004)。該系統可以通過在表達外源膜蛋白的同時合成新膜的方式來將外源膜蛋白整合于其自身的內源膜蛋白系統中, 這一點是很獨特的。

這些新的細胞膜形成使細胞質膜的內凹，允許外源膜蛋白整合。紅細菌屬膜蛋白表達系統非常強有力的一點是在各種情況下表達的蛋白質都幾乎等量地定位于膜。膜蛋白的表達和純化是有難度的，而且用外源表達系統生產的蛋白質的功能必須經過仔細的驗證。

十五、其他載體和誘導條件

除了使用不同的細菌宿主外，外源表達系統的優化還可通過控制載體和誘導條件來實現。其中一個已被證明成功用于蛋白質可溶性表達的此類方法使用了 pCold 載體的冷休克表達系統（Qingetal.，2004)。該系統利用了大腸桿菌細胞的冷休克反應以抑制內源蛋白的產生，同時又增強了目標蛋白質的表達。研究表明，當截短的冷休克蛋白 (CSpA)mRNA 在冷休克的條件 (從 WC 降溫到 15°C 并保持 36 h) 下表達時，多聚核糖體就會被占據用來翻譯截短的 c 分 A 基因，而不能形成 HI 型核糖體去翻譯非冷休克蛋白 (non-cold-shockprotein)(JiangetaL，1996)。結果是，只有在 mRNA 中的基因才會被翻譯，而內源蛋白的表達則受到抑制。在 pCold 質粒中啟動子之后有一個克隆區，用于插入目的基因，使用 1mmol/L IPTG 可以阻遏目標蛋白質的表達，15℃ 冷休克可以誘導目標基因的過表達，由于宿主背景蛋白的表達極低，該技術表達的外源蛋白通常可以不用純化，這大大消減了生產成本。