磷酸化位點分析實驗磷酸化位點的確定

蛋白樣品

過去確定磷酸化位點測序最常用的是逐步化學降解法，如絲氨酸和蘇氨酸磷酸化分析方法、酪氨酸磷酸化分析方法, 最近，此方法已經主要被質譜方法所取代 。非放射活性和放射活性磷酸肽測序的方法，這兩種方法可以補充．在某些情況下可以替代質譜方法來確定磷酸化位點。非放射活性方法是用于檢測磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨胺，包括β-消除，與巰基乙醇反應形成s- 乙基化半胱氨酸或β-甲基-s-乙基半胱氨酸，它們很容易以 PTH 衍生物的形式從自動測序儀中提取出來。放射活性方法是由 Ceerenkov 計數檢測器檢測在 Edman 化學降解測序僻環中釋放出的放射性活度。如果測絲氨酸或蘇氨酸磷酸鹽殘基，磷酸鹽被除去，可觀察到³²p-磷酸鹽和各自的 PTH衍生物。在酪氨酸磷酸鹽情況下，磷酸酯鍵更穩定，分析的提取物是 PTH 磷酸酪氨酸。如果得到的磷酸肽的量非常有限，也許不可能用化學降解法測肽序列，但是在降解循環后，放射活性從肽中釋放，通常有可能確定肽內磷酸化位點。