光譜染色體核型分析實驗

光譜染色體核型分析（SKY)采用24種顏色對所有染色體進行涂染，在一次試驗中可以觀察到每一條染色體。該技術以光譜成像和傅里葉光譜學原理為基礎。對流式分選的染色體進行PCR標記，直接標記熒光素或間接標記半抗原。5種光譜學不同的純色染料進行組合得到獨特的染色體探針混合物。探針混合物與中期染色體雜交，用高級的圖像分析方法進行檢測。

組織樣本

37℃預熱的1X胰酶 檸檬酸鹽 甲醇：冰乙酸=3:1(V:V) 1×PBS 20×SSC

37℃溫箱或水浴鍋 15mL錐形底離心管

一、探針

已經標記好的商品探針以混合形式溶解在雜交液中。

二、從組織中制備染色體

1.在組織培養用的超凈工作臺中進行無菌操作，在無菌培養皿中，用刀片將組織切碎成細小的塊。

2.將細碎的組織塊轉入有足夠培養基的、具有通氣孔的組織培養瓶中；培養基要蓋過平面放置的培養瓶底（通常10?15mL)。

3.將培養瓶放入CO₂培養箱中，靜置培養24h。

4.光鏡下觀察其生長狀態。

5.當達到要求的生長狀態或培養時間時，向培養瓶中加入秋水仙胺至終濃度10μg/mL，在CO₂培養箱中繼續培養2?3h。

6.將培養基和懸浮的組織或細胞一起轉移到15mL錐形底離心管。對于非貼壁細胞，繼續步驟10。

7.向培養瓶中加入10mL檸檬酸鹽溶液，漂洗貼壁的細胞，棄去檸檬酸鹽溶液。

8.向培養瓶中加入10mL 1×胰酶。觀察貼壁細胞自培養瓶壁上脫離，輕輕吹打，將細胞自瓶壁上吹打下來，轉移到15mL錐形離心管中。

9.向含有貼壁細胞的15mL錐形離心管內加入5mL新鮮配置的培基

10.1500g離心10min收集細胞。

11.倒掉或吸出上清，只留下0.5?1mL溶液。用手指輕輕敲打管底，打散細胞團。

12.加人預熱的0.075mol/L KCl溶液，開始的1mL逐滴加入，滴加中間混勻;然后將剩下的14mL加入并輕輕顛倒混勻，37℃放置10min。

13.加入5滴比例為3:1的甲醇：冰乙酸，混勻。

14.1500g離心10min。

15.倒掉或吸出上清，打散細胞團。加入新鮮配置的甲醇：冰乙酸（3:1)固定液15mL，用上述的方法開始的1mL逐滴加入，滴加中間混勻；然后加入剩余的14mL固定液，并輕輕顛倒混勻。

16.1500g，離心.10min。

17.重復步驟15的固定。然而，最初的1mL不需要逐滴加人。離心，重復固定3次。

18.細胞懸液可以以固定液中細胞團的狀態-20℃保存。

19.為了進行染色體標本制備，倒掉固定液，重懸細胞團塊，加入適量的新鮮固定液使懸液輕度渾濁。

20.用200μL的槍，吸取100μL懸液，滴到干凈的載玻片上，室溫下晾干并儲存片子。滴好的片子至少自然老化2d或37℃過夜老化。

三、染色體標本預處理和變性

1.染色體標本至少自然老化2d或用前37℃過夜。

2.染色體標本在系列乙醇（70%、80%和95%)中分別脫水5min，晾干。

3.加入15?20μL的10%胃蛋白酶儲存液到50mL預熱的0.01mol/L HCl中，將染色體標本在37℃染色缸中溫育5min。同時，準備一缸70%甲酰胺/2×SSC溶液并放入75℃水浴中預熱。

4.取出標本，在室溫下的1×PBS中漂洗5min。

5.在1×PBS/MgCl₂室溫溫育5min。

6.向50mL 1×PBS/MgCl₂中加入1.5mL37%甲醛，在室溫下的該溶液中溫育標本10min。

7.在室溫中的1×PBS中漂洗5min。

8.按步驟2中所述方法再次進行系列乙醇脫水。

9.晾干片子后，檢查甲酰胺溶液的溫度是否達到75℃;將染色體標本在75℃甲酰胺溶液中變性2min。

10.迅速將標本轉移到冰冷的70%乙醇中并用系列乙醇脫水后晾干。

四、探針變性

1.對于每張標本，22mm×22mm蓋玻片的范圍內需要用10μL探針；如果該區域大于此范圍，增加探針的使用量。取適量的探針到一個Eppendorf管中。

2.在水浴鍋或PCR儀上75℃熱變性探針10min。

3.將探針于37℃水浴中預復性1h。

五、雜交

1.從37℃中取出預復性的探針，小心的加到變性的中期染色體標本上。因為探針既有直接標記又有間接標記，應迅速操作并避免長時間暴露在光線條件下。

2.小心的蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡。如果出現氣泡，輕按蓋玻片，將氣泡擠出。

3.用橡皮泥封好蓋玻片邊緣。

4.放入雜交盒，并放入塑料袋中（可選擇的），在37℃條件下雜交48h。

六、雜交后洗脫和檢測

1.在45℃水浴中預熱所有的溶液。

2.從雜交盒中取出片子，小心除去橡皮泥。蓋玻片也許隨橡皮泥一塊揭去或仍留在片子上。如果蓋玻片留在片子上，直接將標本放入第一缸洗脫液。

3.在50%甲酰胺/2×SSC中洗3次，每次5min。在第一次洗脫時蓋玻片應滑掉。輕輕振蕩染色缸幾秒鐘。

4.在1×SSC中洗片3次，每次5min并輕輕振蕩。

5.標本浸在0.01%Tween-20/4× SSC中，取出標本，甩掉多余的液體，但保持片子表面濕潤。

6.取30?40μL SKY試劑盒（AppliedSpectralImaging提供）的瓶2中的封閉液加到標本上，蓋上蓋玻片。

7.將標本放回雜交盒，37℃溫育30min。

8.小心移開蓋玻片，取30?40pLSKY試劑盒的瓶3中的檢測溶液加到片子上，并蓋上蓋玻片。

9.將標本放回雜交盒，37℃溫育約30min。

10.小心移開蓋玻片，在0.01%Tween-20/4× SSC中洗3次，每次5min。輕輕振蕩。

11.甩掉多余的液體，取30?40μL SKY試劑盒的瓶4中的檢測溶液加到標本上，蓋上蓋玻片。

12.將標本放回雜交盒，37℃溫育30min。

13.小心移開蓋玻片，在0.01%Tween-20/4×SSC中洗片3次，每次5min。輕輕振蕩。

14.在室溫下的2×SSC中漂洗片子。

15.用15?20μL瓶5中的DAPI/抗淬滅劑封片，蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。

16.可以進行閱片。標本應在-20℃保存。

七、圖像抓取

1.盡可能及時的進行圖像抓取和分析。盡管熒光素在-20℃并盡可能少的光線條件下能保存幾個月，但隨著時間的延長，信號強度會減弱。'

2.在實驗室安裝系統時進行用該系統抓取圖像和分析的培訓。

八、用SKY探針與曾G顯帶過的中期染色體標本的雜交：標本預處理

1.在室溫下的二甲苯中洗2次，每次5min，除去G帶標本上殘留的鏡油

2.將標本浸在甲醇中10?15min褪色，或直到標本完全褪色。

3.標本褪色后，進行系列乙醇再水合：95%、80%和70%乙醇，每5min，瞭干。

4.繼續從三的步驟5開始。

5.如果標本曾顯帶過，在70%甲酰胺/2×SSC中變性時間需調整以反映標本特性。保守變性時間為40s。

1.如果材料充足，嘗試不同的秋水仙胺作用時間，以得到最適合細胞遺傳學分析的染色體長度。通常，不同組織和腫瘤類型之間的生長模式也不同。對于生長較慢的細胞，秋水仙胺過夜處理能得到較多的中斯分裂相，但這種處理要求秋水仙胺的濃度相當得低。而對生長較快的細胞，秋水仙胺作用時間較短，可能只需要30min，就能夠成功將大量細胞阻斷在中期進行標本制備。通常建議在收獲細胞前一天進行半量換液，從培養瓶中取出一半的培養基，加入等量的新鮮培養基。細胞對秋水仙胺的敏感性也是獲得好的中期染色體分裂相的關鍵B素。試驗發現：一些腫瘤細胞對秋水仙胺的耐受程度很低，很容易得到短粗的染色體。相應降低秋水仙胺的終濃度并延長作用時間可以在某種程度上減弱這種現象，但可能會導致一定數量的中期染色體分裂相減少。

2.培養基中既有懸浮細胞也有貼壁細胞時，為保證標本制備中收集到所有的腫瘤細胞，建議同時收集懸浮在培基中的細胞。收集后，將這些細胞加入到胰酶處理得到的其他貼壁細胞中。

3.用含有胎牛血清的新鮮培養基漂洗收集的細胞有助于滅活胰蛋白酶。既然胰蛋白酶是一種蛋白酶，過長時間的胰蛋白酶處理會破壞細胞膜、損傷DNA。

4．KCl通常用作低滲液使細胞脹大。最初的1mL溶液要逐滴加入，防止水液體的沖擊造成細胞破裂釋放細胞內容物。加入每滴溶液后都輕輕混勻，確保低滲液和細胞懸液混勻。37℃的微熱處理令細胞脹大得更快。如果沒有37℃溫育，室溫放置30min也能充分的脹大細胞。如果細胞沒有脹大，依次延長低滲溫育時間5min再進行隨后的收獲步驟。

5.低滲脹大后的細胞非常敏感。逐滴加入甲醇：冰乙酸固定液進行預固定，有助于堅固細胞膜以進行之后的離心和固定。加入固定液也會破碎所有的紅細胞。離心后，細胞團塊的大小應會加倍，說明低滲處理的成功。

6.細胞離心成團后，去上清。上清中可能含有破碎的膜和細胞質物質。輕敲錐形離心管底使細胞團塊重懸。逐滴加人固定液有助于使固定液緩慢進入脹大的敏感細胞。

7.有許多種方法可用來進行中期染色體標本的制備。某些實驗室用1mL—次性球形吸管、玻璃滴管或移液槍將固定好的細胞滴加到載玻片上。尤其當細胞數量少時用200μL的移液槍便于控制細胞懸液的使用量。細胞懸液通常滴加到傾斜45°角的載玻片上，可以是干片，也可以是浸在水或固定液中的濕片。這些不同的制片方法來自于不斷摸索。比較潮濕的房間或季節會影響制片效果。如果空氣太干燥，用加濕器或用沸騰的壺水或電熱板加熱水產生的水蒸氣來提高空氣濕度。如果環境太潮濕，將玻片放在電熱板上幾秒鐘，加快干燥速度。制備的標本需經常在相差顯微鏡下觀察，以確定目前的制片方法是否合適。為確保SKY實驗的成功，標本上分裂相周圍的胞質盡可能得少、染色體不能太長或相互交叉。根據需要調節細胞濃度。通常染色體呈深灰色，依稀能看見帶型。標本可以保存在室溫下的玻片盒中，并在兩周內使用，也可在第二天盡快使用。當標本開始老化后，將更難于變性，發生降解使DNA毫無用處。

8.胃蛋白酶是用于前處理的最溫和的蛋白酶。配制10%(m/V)的胃蛋白酶儲存液并分裝，可以在-20℃條件下幾乎永久保存。按每次的使用量分裝胃蛋白酶。每一批新的胃蛋白酶都是不同的，因此獲得最干凈標本的前處理的使用量可能不同。

9.一種能控制蛋白質消化程度的保守方法是用等量的胃蛋白酶，但延長溫育時間。提高胃蛋白酶的使用量要求更嚴格的計時，相形比之下前一種方法更有彈性。輕輕振蕩能夠促進胞質碎片的松開。蛋白酶處理后可以在相差顯微鏡下觀,察蛋白質的消化程度，但需要在甲醛固定之前。

10.甲醛有助于維持染色體形態，但也造成DNA難于變性。盡管2min的變性時間足以將DNA成為單鏈，對于片齡比較長的標本（超過2個月）甲醛處理可使變性時間縮短。如果是片齡比較長的標本，縮短甲醛處理時間到5min。之前曾G顯帶過的標本，經過胰酶消化顯帶和熱處理人工老化的劇烈處理，用甲醛固定有助于維持染色體的形態

11.用甲酰胺作變性液，因為它能夠降低DNA的熔點。用溫度計測量保證甲酰胺溶液達到變性溫度。塑料染色缸內的溶液一般比外面水浴鍋的溫度低3?4℃，因此應提髙水浴鍋的溫度。玻璃染色缸更易于傳熱；在染色缸中每加一張標本溶液溫度會降低，因此每增加一張變性標本水浴鍋的溫度就大約上調TC。所以，使用玻璃染色缸變性5張標本時，水浴鍋的溫度應設定在78?79℃，這樣變性液的溫度在74?75℃。2min是變性的標準時間，然而，可以根據標本的質量和片齡調整變性時間。對于新鮮制備的標本（片齡1?3d)，DNA可能還沒有完全老化，盡管用甲醛固定促進老化，但DNA仍然很脆弱，將變性時間縮短到90s就足夠了。雜交后在顯微鏡下觀察確定標本是否過度變性，染色體可能發生脹大，沿著每條染色體或染色單體的軸具有可見的骨架，或者邊緣清晰但染色黯淡的染色體。變性過度的標本不能像適當變性的標本一樣被DAPI復染，一般只有著絲粒呈現亮熒光染色。因為過度變性破壞了DNA結構，也可能只有少數.探針與靶DNA雜交。片子變性不夠的時候，鏡下觀察到染色體完整但雜交信號分布不均。染色體容易被DAPI著色，說明DNA沒有被過度處理，結構沒有被破壞。

12.標本變性是FISH相關試驗最關鍵的步驟。標本變性結束，必須立刻轉移到70%的乙醇中以保持DNA的單鏈狀態，乙醇可以是冰冷或室溫的。并不需要每一步都更換乙醇，70%乙醇可以一次試驗后進行更換，80%和95%乙醇可以一次加滿后，每2次試驗后進行補充。如果沒有條件在-20℃保存乙醇，也可以室溫保存，但是必須密閉保存以免蒸發。

13.任何不透光的容器都可以作為雜交盒，黑色錄像帶盒就是一種非常好的雜交盒。盡管盒子并不需要潮濕，但我們的經驗是用一片濕紙巾或濕紗布（不要濕透）墊在盒底會有利于雜交。一定要用干凈的蒸餾水，因為細菌可能會在片子上生長，與抗體結合后產生不必要的背景。也可以選擇將雜交盒放在塑料袋中，防止雜交盒干透。雜交后的所有洗脫都應該伴隨輕輕振蕩，將未結合的抗體或探針洗脫下來使標本干凈；確保所有試劑中無可以結合抗體的任何細菌。如果在UV顯微鏡下背景很高，應加大洗脫力度：每一步增加一次洗脫并更劇烈的振蕩，或調節溶液濃度。以Tween-20的濃度為例，可以在0.01%?0.2%進行調節。洗脫或抗體溫育的過程中如果標本干了，也會產生背景。

15.之前曾進行過G顯帶的標本通常是來自臨床細胞遺傳學實驗室的唯一樣品來源。這些標本的保存和預處理使進行隨后的FISH分析難度很大；然而有幾步操作可以提高其FISH的成功率。表1列出一些要進行SKY分析的G帶標本制備應遵循的原則。G帶分析后，這些標本可以用二甲苯或其他試劑處理去除殘留鏡油，因為這些鏡油能快速降解DNA。如果標本已經封片，封片劑也可能降解DNA，這可能是無法避免的，但是通過調節蛋白酶處理（這步可以省略因為G顯帶標本用胰蛋白酶處理過）、變性時間和甲醛固定等，以避免進一步損壞DNA。

16.之前進行過G顯帶的標本變性時應調節變性時間。在G顯帶過程中，DNA已經劇烈作用過，包括胰酶消化去掉細胞質和一些與DNA結合的蛋白質而強化帶型，高溫處理得到反差更好的染色帶型。加上浸在鏡油中，靶DNA通常是相當脆弱的狀態，因此變性時間縮短到40s。也可以在正式實驗前，用同樣制備和處理方式的其他來源標本進行預實驗。這將為分析是否有效、標本可以承受多少處理提供依據。

17.盡量拍攝周圍無細胞核的中期染色體分裂相。雖然染色體的熒光通常跟周圍的核一樣或更強一些，但較小的細胞核發出的非常強的熒光將改變中期染色體分裂相的熒光強度，因為抓取圖像時會自動調節對比度。

18.抓取圖像的時候盡量避免拍到明亮的斑點。和上面所述的原因相同，.結合抗體造成的外源性亮點不能被洗脫掉，會導致靶染色體的信號強度降低。

19.如果可能，盡量選擇相互交叉少的中期染色體分裂相。但在中期染色體分裂相數量很少或者細胞懸液中染色體長時這種情況就不可避免。染色體的交叉可能導致“易位”的錯誤判斷，因為染色體交叉結合在一起形成的熒光組合可能與SKY光譜庫中的某種模式一致。

20.為節省硬盤空間和縮短圖像抓取時間，只選擇有意義的中期染色體分裂相進行圖像抓取，而避開中期分裂相周圍的大片無信號區域。