膜蛋白的純化實驗

實驗步驟

一、膜的制備

從細胞或組織中分離質膜是純化膜蛋白的第一步。由于缺少能有效分離去污劑增溶的膜蛋白的生化方法，因此在質膜成分純化上投人一些時間會對后續步驟的結果有利。

大多數膜蛋白的含量較低, 因此選擇易于大量獲取并能高表達目的膜蛋白的組織或細胞系就很重要。最近，人們對于將細胞表面蛋白質作為鑒定不同細胞系或干細胞的標示物的研究興趣逐漸增加。而作為其影響之一, 如何從有限數量細胞中獲取足量的細胞膜 ，并能較好富集質膜標示物的酶活性，已經成為膜分離領域新的關注點。

制備細胞膜成分需要打碎組織或細胞，最 常 用 的 方 法 是 用 杜 恩 斯 勻 漿 器（Douncehomogenizer)將組織或細胞在等滲的蔗糖緩沖液中(0.25m d /L ，p H 7?8)勻菜。膜蛋白整合在細胞膜內時相對比較穩定。而細胞破碎時可能會釋放蛋白酶，因此蛋白質水解導致的失活是膜純化過程中最需要考慮的問題。商業上有方便的片劑形式提供的蛋白酶抑制劑的雞尾酒式混合劑，如完全蛋白酶抑制劑雞尾酒式混合劑[complete protease inhibitor Cocktail (R o c h e ,Indianapolis，I N )]。 膜蛋 白的胞外結構域直接接觸氧化環境 ，并且大部分的巰基都以二硫鍵形式存在，這些二硫鍵都是蛋白質在內質網中加工時形成的。因此, 還原劑在這一步驟中也許不需要。實際上，高濃度的還原劑會改變現存二硫鍵的構象 ，導致膜蛋白酶活性失活或配體結合活性喪失。由于二硫鍵結構和糖基化修飾, 相對而言 ，膜蛋白的胞外結構域對蛋白質水解具有較高的抵抗性。然而也有例外。例 如 ，Ca?依賴的細胞黏附分子C a d h e r m s ，當 C a 2+ 被 E D T A 除去時易受蛋白質水解。相反，介導膜
蛋白信號轉導的胞內區通常易被蛋白質水解。如胰島素受體，如果在勻漿和后續膜分離步驟中沒有足夠量的蛋白酶抑制劑，其受體酪氨酸激酶活性將會極大的喪失。

最常用的膜分離方法采用差速離心和蔗糖密度梯度離心的組合。由于脂質和蛋白質組成上的差異，細胞膜具有不同的密度使其可與其他細胞器分離。差速離心可以從細胞勻漿中去除可溶性蛋白質、大部分的線粒體和細胞核。蔗糖密度梯度可進一步分離不同密度的細胞膜。然 而 ，多步離心過于冗長并且只能獲得質膜的一小部分。一般許多質膜在較早的離心步驟中丟失。因此，這種方法更適合于從較易獲取的組織中分離細胞膜。在生化研究中，大鼠的肝臟就是最常用于分離細胞質膜的組織之一。已經有了很多從大鼠肝臟中分離不同膜成分的方法。 Neville( 1%8)使用的方法是在低滲溶液中勻漿肝臟，隨后采用不連續的蔗糖梯度離心，這種方法能夠非常好的回收肝臟質膜并且已經得到了廣泛應用。

在只使用少量組織培養細胞的情況下，需要增加質膜蛋白的回收率的同時不犧牲膜的純度。親和基質提供了一種簡單快速的膜純化方法。傳統的瓊脂糖或丙烯酰胺親和基質不能用于分離細胞膜，因為它們會沉淀相對密度高的細胞器(如細胞核）。化學方法處理的磁珠可與多種蛋白質偶聯, 這已經成為了親和基質的一種新形式。與傳統的瓊脂糖或丙烯酰胺親和基質不同，磁珠能夠用磁鐵方便的從混合物中分離出來，因此可用于分離細胞器并且與細胞器的密度無關。只需簡單地將裝有磁珠的離心管靠近磁鐵, 磁珠即可在離心管中接近磁鐵的一端被回收, 從而輕易地從混合物中分離出來。因 此 ，磁珠可作為離心的替代方法。這一性質對于將質膜與其他細胞器分離會具有很大優勢。我們最近用固定凝集素的磁珠從培養的上皮細胞中純化出了膜蛋白（Leeetal. ,2008)。這個步驟利用了以下事實，即一些膜蛋白是糖基化的并且能夠結合凝集素—糖 結 合 蛋 白 在 這 一過程中，生物素化的凝集素伴刀豆蛋白A(concanavaIin A ,ConA)與鏈霉親和(streptavidin)磁珠相結合, 從而將ConA固定于磁珠。帶有ConA的磁珠與勻漿的細胞裂解液混合 ，磁珠在離心管的一端被回收，從而將與磁珠不結合的其他細胞器去除。 5’核酸酶是一個膜蛋白，與前列腺PC-3細胞或宮頸HeLa細胞總的細胞裂解物相比，它的活性在ConA的磁珠回收后得到了增強，從而表明細胞膜與ConA磁珠有結合。凝集素磁珠方法的一個缺陷是，我們無法使用競爭性糖a-甲基甘露糖(alpha-methyl mannoside)將細胞膜從ConA磁珠上洗脫下來。這可能是因為競爭性的糖不能進人細胞膜和ConA磁珠之間的結合位點。因此，我們使用去污劑將膜蛋白從ConA磁珠上溶解下來。利用去污劑增溶
膜蛋白會在本章第3 節中介紹。

二、天然膜蛋白的增溶

膜蛋白嵌人脂雙層中。整合膜蛋白至少有一段蛋白質序列嵌入細胞膜中，而外周蛋白則通過靜電相互作用或某些情況下通過疏水相互作用與細胞膜相聯系。用高鹽或高p H 溶液司以從膜上解離外周膜蛋白（Schindler et aL ,2006), 如 0?5m o l / L N a C l 。由于這一過程中不使用去污劑, 外周膜蛋白可以用與可溶蛋白質類似的方法純化。

在純化前，整合膜蛋白需要從脂雙層中增溶出來，從而成為單獨的蛋白質。具有兩親性 (amphipathic)的去污劑通常用于從細胞膜中增溶整合膜蛋白。去 污 劑 也 許 可 分 為 3種類型: 離子型、非離子型和兼性離子型（zwitterionic)。 本 書 第 4 1 章討論了去污劑的不同類型。因此，接下來我們只討論去污劑在膜蛋白純化方面的應用。

去污劑處理后的細胞膜在105 000 g 、4°C 離 心 I h 后, 如果膜蛋白在上清液部分，則認為膜蛋白從細胞膜中「溶解」出來了。去污劑溶解膜蛋白的這一過程可被分為幾個階段 。第一階段，去污劑結合細胞膜。隨著去污劑含量的增加, 去污劑開始裂解細胞膜。去污劑含量的進一步增加會導致形成脂質/蛋白質/去污劑的復合物。這 時 ，膜蛋白被「溶解」。此時還需要額外的去污劑將上述復合物「脫脂Y d e U p k k t e )為蛋白質/去污劑復合物和脂質/去污劑復合物 。 一 般來說，去污劑和蛋白質的比例為1 ? 2 時就足以將膜蛋白溶解為脂質/蛋 白 質 /去 污 劑 復 合 物 ，比 例 為 1 0 左 右 或 更 高 時 會 導 致 復 合 物 的 脫 脂
(Hjelmeland,1990)。對 于 特 定 的 膜 蛋 白 , 溶 解 膜 蛋 白 的 最 佳 去 污 劑 和 蛋 白 質 比 例 需 要 通過 實 驗 確 定 。

去 污 劑 的 選 擇 可 以 簡 單 地 表 述 為 選 擇 能 夠 對 目 標 蛋 白 質 起 作 用 的 去 污 劑 。非變 性 去污 劑 能 夠 增 溶 膜 蛋 白 而 并 不 使 其 失 活 或 功 能 喪 失 。在 可 供 選 擇 的 去 污 劑 中 ， Triton X— 100、膽酸鈉(sodium cholate)、C H A P S 、辛基葡糖昔(octylglucoside)在 大 多 數 情 況 下 是 非 變
性 」的 ，雖 然 在 溶 解 過 程 中 會 損 失 一 部 分 的 活 性 。

去污劑的存在會在多個方面影響蛋白質的純化。去污劑會影響蛋白質活性的檢測，如去污劑會影響細胞膜轉運蛋白的轉運活性，而對受體來說，去污劑則會影響其配體結合活性。由于蛋白質不再與細胞膜聯系在一起，測量轉運活性需要將可溶膜蛋白重組合到磷脂囊泡中。并且對于特定的受體，也需要能將沒有結合的配體從配體-受體復合物中分離出來的方法。這些要求也許會限制增溶時使用的去污劑類型。例 如 ，如果后續需要將膜 蛋 白 重 組 合 到 磷 脂 囊 泡 中 ，則 應 該 使 用 具 有 高 臨 界 膠 束 濃 度 的 去 污 劑（膽 酸 鈉 、C H A P S 、辛基葡糖苷），因為它們更易通過透析方法去除。

一 些類型的去污劑會干擾 蛋 白 質的某些檢測。聚氧乙烯的衍生物，如 Triton X-100、C 12E 9和 t w e e n 系列會在考馬斯亮藍0 2 5 0 染料結合測量(又被稱為Bradford檢測）中產生假陽性(Bradford, 1976) 。 而膽酸鈉或脫氧膽酸鈉會在Bradford測量中產生沉淀。Triton X-100和 NP-40在 280 nm波長處有吸收從而會在色譜中干擾紫外線吸收方法監測洗脫蛋白質。這需要改變蛋白質檢測方法或選擇與蛋白質檢測方法兼容的去污劑。雙金雞寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測方法（Smith et al. ,1985)可兼容某些去污劑 。有一種基于Lowry蛋白質檢測法(Peterson,1977)的改良方法，通過脫氧膽酸鹽和三氯乙酰酸(trichloroacetic acid，T C A )首先將蛋白質從溶液中沉淀出來，這能夠避免去污劑的干擾并可在整個純化過程中測量蛋白質的濃度。然而，改良的Lowry法 與 Bradford法相比需要花費較長的時間。

某些情況下，去污劑的純度非常重要。例如，去污劑中的雜質會干擾X 射線結構分析或質譜分析。聚氧乙烯衍生物，如 Tnton X-100、 LubroI PX、tween、Brij系列包含了各種長度的聚合物并且在化學上是不均一的。而辛基葡糖苷、十二烷基麥芽苷和CHAPS則具有非常明確的化學組成，可以得到相對高的純度。非離子型去污劑，包括如Triton X-100和 tween系列的聚氧乙烯衍生物，在離解蛋白質復合物方面沒有離子型去污劑有效, 但許
多蛋白質在非離子去污劑中更穩定。

篩 選 能 夠 溶 解 整 合 膜 蛋 白 的 去 污 劑 ，必 須 首 先 辨 別 那 些 能 夠 增 溶 但 不 失 活 膜 蛋 白 的去 污 劑 。在 滿 足 這 些 要 求 后 ，還 需 要 考 慮 其 他 因 素 , 包 括 與 蛋 白 質 檢 測 、鑒 定 和 層 析 方 法的 兼 容 性 。去 污 劑 與 各 種 層 析 方 法 的 干 擾 將 會 在 本 章 第 4 節 討 論 。

篩 選 去 污 劑 時 ，需 要 制 備 如 I mg/mL特 定 蛋 白 質 濃 度 的 細 胞 膜 組 分 ，隨 后 加 人 0. 2?20 mg/m L 不 同 濃 度 的 去 污 劑 溶 液 。通 常 在 去 污 劑 /蛋 白 質 的 比 例 為 0?1? 10(w/w) 時能 夠 發 生 增 溶 。溶 液 在 〇 ? 4°C孵 育 3〇?60 min, 隨 后 4°C 、105 000 g 離 心 I h 。接下 來 在上 清 液 和 沉 淀 中 檢 測 目 標 蛋 白 質 的 活 性 。如 果 大 部 分 的 活 性 出 現 在 上 清 液 中 ，則 說 明 此去 污 劑 適 合 該 膜 蛋 白 。如 果 活 性 在 上 清 液 中 沒 有 出 現 而 出 現 在 沉 淀 中 ，則 此 去 污 劑 不 能從 細 胞 膜 中 溶 解 出 該 蛋 白 質 或 去 污 劑 加 入 的 量 不 夠 。而 如 果 活 性 在 上 清 液 和 沉 淀 中 都 沒
有檢測到，則此去污劑使目標蛋白質失活。

三、膜蛋白的純化

一 旦 使 用 了 合 適 的 去 污 劑 將 膜 蛋 白 從 細 胞 膜 中 増 溶 出 來 ，就 可 以 分 離 目 標 蛋 白 質 了 。傳 統 色 譜 層 析 技 術 ，如 凝 膠 過 濾 、親 和 、離 子 交 換 和 層 析 聚 焦 （chromatofocusing)等 都 可以 用 于 膜 蛋 白 純 化 。然 而 ，在 去 污 劑 存 在 條 件 下 使 用 色 譜 層 析 需 要 注 意 以 下 幾 點 。

(1) 使用足量的去污劑，以維持整合膜蛋白在緩沖液中處于可溶形式并防止蛋白質聚集。

(2) 由于大多數去污劑具有疏水性，基于蛋白質疏水性的蛋白質分離方法，如苯基-瓊脂糖凝膠和反相層析也許不適于膜蛋白的純化。

(3) 增溶膜蛋白的離子型去污劑，如膽酸鹽或脫氧膽酸鹽，不適用于離子交換層析。非離子型或兼性去污劑則可用于基于電荷的制備技術, 包括離子交換層析和制備電泳。

(4) 含糖基的去污劑也許會干擾特定的凝集素層析，如 辛 基 葡 糖 苷 會 干 擾 ConA層 析 。

(5) 由于溶解的膜蛋白處于去污劑膠束中，在凝膠過濾中膜蛋白具有更大的表觀分子質量。能形成大分子質量膠束的去污劑，如 Trtion X-100, 會使溶解的膜蛋白的分子質量 增 加 60?100 kDa。因此, 大多數蛋白質會出現在高分子質量部分，從而使基于分子大小的蛋白質分離變得困難。

(6) 膜蛋白與去污劑膠束的結合，特別是具有大膠束尺寸或本身為離子型的去污劑，會遮蔽膜蛋白的電荷。因此，離子交換層析分離膜蛋白的能力也許不如非膜蛋白。

(7) 整體而言，親和層析是目前純化整合膜蛋白最有用和最成功的方法, 并且在各個純化階段都能使用。由于離子交換層析對緩沖液的離子強度敏感，而凝膠過濾要求相對小體積的濃縮樣本, 因此親和層析可以用于純化、濃縮以及在不同層析步驟中進行鹽置換 。幾種常用的膜蛋白純化的親和層析方法將在下面的部分中闡述。

4.1 凝集素親和層析

有 3 種類型的親和層析分別使用一般配體(如凝集素）、特異性配體(如酶抑制劑、激素)和抗體。固定的凝集素是親和層析的常見形式。凝集素是糖結合蛋白，可用于快速并溫和地純化質膜糖蛋白。凝集素-糖的相互作用可逆并且可以被單糖抑制。由于膜蛋白常常是糖基化的，因此凝集素層析對于純化膜蛋白非常有用。 目前已經鑒定了大量的凝集素 ，其中使用最廣泛的是ConA[結合右旋甘露糖ct(crI> mannose)]和麥胚凝集素[germ
agglutinin, 結合唾液酸和乙酰氨基葡萄糖(3(sialic acid and ^ I> GIcNAc)]。這里需要提及使用凝集素親和層析的幾個方面。首先 ，目標蛋白質是否能夠與特異的凝集素結合需要實驗驗證。由于不同的組織具有不同的糖基化酶，有時在相同動物的不同組織表達的同一糖蛋白也許會具有不同的凝集素結合特異性。其 次 ，特定的凝集素的親和層析純化的是一組具有特定糖基化類型的糖蛋白，因此并不能達到配體或抗體親和層析方法達到
的純化程度。最 后 ，凝集素對特定類型的去污劑敏感。雖然非離子型去污劑，如 Tritonx -100(可 至 2. 5 % ，m /V )對 C o n A 或麥胚凝集素配體結合活性的影響可以忽略，但一些離子型去污劑，如 S D S 也許會失活凝集素。

下面是一個使用凝集素柱純化膜蛋白的實驗方案范例。

(1) 轉 移 2 mL麥胚凝集素(WGA)-瓊脂糖到一 次性的塑料柱子(PolyPrep，Bio-RadLaboratories) 中 ，清 洗 WGA-瓊 脂 糖 親 和 基 質 。用1〇 mL 清 洗 緩 沖 液 [50 mmol/LH E P E S ( p H 7. 〇 、0.1 % 去污劑]充滿柱子，讓洗液流過柱子以除去未結合的W G A 和保存緩沖液。

(2) 在溶解的細胞膜提取物中加入清洗過的WGA-瓊脂糖。在室溫轉動或振蕩器上振 蕩 3〇 min, 使 WGA-瓊脂糖和可溶細胞膜提取物混合。

(3) 600 r/m in 離 心 I m in 以沉淀 WGA-瓊脂糖。用移液管吸出上清液。加 入 1〇倍體積(基于WGA-瓊脂糖的體積)的洗液，顛倒數次。

(4) 重復步驟(3)兩次。

(5) 加 人 2 m L 洗液到W G A -瓊脂糖，再 將 W G A -瓊脂糖移回柱子。用 5?10倍柱體積的洗液清洗。定時進行蛋白質檢測，如用考馬斯亮藍蛋白質檢測方法直到蛋白質水平降至背景值，即與洗液中蛋白質水平相似。

(6) 加人一半柱體積的洗脫緩沖液, 如5〇 mmol/L H E PE S(PH 7. 4)、0. 1 % 去污劑、0?25m 〇I/L N -乙酰氨基葡糖, 從W G A -瓊脂糖上洗脫糖蛋白。收集洗脫部分。

(7) 加人一半柱體積的洗脫緩沖液, 收集洗脫部分。

(8) 重復步驟(7)4次。

(9) 檢測洗脫液中的蛋白質濃度。例如, 從每份洗脫液中吸出5 pL 并用考馬斯亮藍方法檢測蛋白質濃度。將適當的部分匯集在一起。

4.2 配 體 親 和 層 析

配體親和層析成功的關鍵是配體和受體的親和要足夠強，能夠允許純化步驟中的結合和清洗。配體通常通過偶聯固定到親和基質（affinity support)上 。由于去污劑的存在 ，配體(或抑制劑）和受體的親和性也許會被改變。因此, 如果使用配體親和柱純化, 關鍵在于選擇不會顯著降低受體和配體親和活性的去污劑。

4.3 抗 體 親 和 層 析

如果有可用的抗體，則使用特定膜蛋白的固定化抗體是純化膜蛋白最有力的方法。抗體在非離子型去污劑中相對比較穩定，因此能夠與溶解的細胞膜制備物中的去污劑兼容 。困難在于從免疫親和柱上洗脫膜蛋白（ 詳 見 第 2 8 章）。

四、去污劑的去除和置換

如果將去污劑完全去除，大多數膜蛋白會聚集并沉淀。因此，為了保持膜蛋白的功能 ，在去除一種去污劑的同時通常會引入另一種去污劑。在一些情況下, 如在起始增溶階段 ，樣品中過量的去污劑會干擾蛋白質的活性和濃度測量，這時需要去除過量的去污劑。在 另 一 些 情 況 下 ，用 于 增 溶 的 起 始 去 污 劑 也 許 不 適 于 后 續 的 層 析 或 分 析 步 驟 ，有 必 要 置 換為 另 一 種 去 污 劑 。例 如 ，離 子 型 去 污 劑 與 離 子 交 換 層 析 和 等 電 聚 焦 不 兼 容 ，需 要 將 其 置 換為 非 離 子 或 兼 性 去 污 劑 。如 果 膜 蛋 白 需 要 重 組 合 到 磷 脂 囊 泡 中 ，需 要 改 為 具 有 高 臨 界 膠束 濃 度 的 去 污 劑 , 從 而 可 以 通 過 透 析 方 法 除 去 去 污 劑 而 使 膜 蛋 白 重 組 合 到 磷 脂 囊 泡 中 。去 污 劑 是 否 容 易 去 除 與 其 性 質 具 有 很 大 關 系 。高 臨 界 膠 束 濃 度 (>1 mmol/L) 的 去 污 劑 ，如 膽 酸 鹽 和 辛 基 葡 糖 苷 ，透 析 或 超 濾 就 能 輕 易 去 除 。低 臨 界 膠 束 濃 度 (<1 mmol/L) 的去污 劑 ，如 非 離 子 型 去 污 劑 Triton X-100、C12E9 、Brij、Tween，很 難 通 過 透 析 去 除 ，可 以 使用 層 析 基 質 吸 附 、凝 膠 過 濾 、平 衡 的 方 法 。去 污 劑 的 去 除 和 置 換 方 法 見 第 4 1 章 。

五、重組整合膜蛋白的表達和純化

蛋 白 質 結 構 研 究 或 為 了 生 產 針 對 膜 蛋 白 的 抗 體 ，通 常 需 要 表 達 和 純 化 重 組 的 整 合 膜蛋 白 以 獲 得 足 量 蛋 白 質 。膜 蛋 白 通 常 采 用 哺 乳 動 物 細 胞 或 昆 蟲 細 胞 表 達 。信 號 序 列 對 于將 蛋 白 質 靶 定 到 內 質 網 非 常 重 要 ，它 會 影 響 蛋 白 質 的 合 成 和 翻 譯 后 的 修 飾 。 因 此 ，標 簽 通常 加 在 序 列 末 端 以 避 免 影 響 蛋 白 質 的 膜 靶 向 過 程 。有 時 ，來 自 其 他 蛋 白 質 的 信 號 序 列 被
用 于 提 高 膜 靶 向 的 效 率 。小 的 標 簽 ，如 His6 標 簽 或 短 肽 標 簽 ，不 會 給 蛋 白 質 帶 來 很 大 的改 變 ，還 能 提 高 異 源 細 胞 表 達 膜 蛋 白 的 概 率 。金 屬 親 和 層 析 具 有 高 親 和 能 力 且 不 受 去 污 劑的 影 響 ,Xt 于 表 達 和 純 化 膜 蛋 白 來 說 是 一 個 好 的 選 擇 。其 他 親 和 表 位 標 簽 ，如 FLAG、 Myc或 H A 也 能 使 用 。然 而 ，用 固 定 抗 體 純 化 蛋 白 質 能 力 有 限 并 且 成 本 比 金 屬 親 和 層 析 高 得 多 。

多 篇 文 獻 中 都 可 找 到 表 達 和 純 化 膜 蛋 白 的 例 子 。一 個 例 子 是 用 昆 蟲 細 胞 表 達 和 純 化細 胞 黏 附 分 子 CEACAMKPhanetaL ,2001)。在 這 個 研 究 中 ，被 表 達 的 整 合 膜 蛋 白 C 端有 一 個 7 個 組 氨 酸 的 標 簽 并 采 用 了 原 始 信 號 序 列 ，結 果 發 現 重 組 的 CEACAM1 蛋 白 定 位于 細 胞 膜 。細 胞 被 裂 解 后 用 Triton X- 1 0 0 溶 解 細 胞 膜 ，并 用 金 屬 親 和 層 析 一 步 純 化 帶His 標 簽 的 CEACM1 。

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