翻譯后修飾蛋白質的定性和定量實驗

一、引言

蛋 白 質 翻 譯 后 修 飾 (P T M ) 在 細 胞 生 物 調 節 中 發 揮 著 基 本 作 用 。 P T M 是 m R N A 翻譯 后 蛋 白 質 的 酶 促 共 價 化 學 修 飾 。蛋 白 質 化 學 修 飾 非 常 重 要 ，因 為 它 們 會 潛 在 地 改 變 蛋白 質 的 物 理 或 化 學 性 質 、組 成 、活 性 、細 胞 定 位 或 穩 定 性 。實 際 上 ，在 氨 基 酸 或 蛋 白 質 的 N端 或 C 端 加 入 或 移 除 化 學 基 團 會 導 致 大 部 分 蛋 白 質 發 生 變 化 。一 些 P T M 可 以 被 動 態 地添 加 或 移 除 ，這 是 一 種 可 逆 的 蛋 白 質 功 能 調 控 機 制 。 目 前 超 過 4 0 0 個 特 定 的 蛋 白 質 修 飾已 被 鑒 定 ，也 許 還 有 更 多 的 修 飾 類 型 有 待 發 現 (Creasy and Cottrell, 2004)。迄 今 為 止 最常 見 的 P T M 有 磷 酸 化 、蘇 素 化 、泛 素 化 、亞 硝 基 化 、甲 基 化 、乙 酰 化 、硫 酸 化 、糖 基 化 及 酰基 化 (表 40.1)。

D N A 和 組 蛋 白 組 成 了 核 小 體 , 而 核 小 體 捆 綁 在 一 起 組 成 了 染 色 質 絲 (chromatin fiber)。組蛋 白 密 碼 (histone code) 假 設 染 色 質 -D N A 的 相 互 作 用 是 通 過 組 蛋 白 上 多 種 P T M 協 同 調 節的 (Jenuwein and Allis，2001; Strahl and Allis，2000)。組 蛋 白 質 上 賴 氣 酸 的 乙 醜 化 最 先 被報 道 ，并 且 與 基 因 轉 錄 活 性 相 關 (Rothet al. , 2001)。組 蛋 白 尾 部 的 甲 基 化 、乙 酰 化 、A D P -核
糖 基 化 、泛 素 化 和 磷 酸 化 等 修 飾 協 同 調 節 特 定 基 因 的 表 達 程 序 (Godde and U r a , 2008)。

磷 酸 化 修 飾 ，最 普 遍 的 P T M 之 一 ，是 許 多 生 化 學 家 的 研 究 主 題 。 目 前 估 計 3 0 % 的人類 蛋 白 質 都 發 生 了 磷 酸 化 (C o h e n , 2001; H u b bard and Coherul” 3 ) 。例 如 ，胰 島 素 /胰島 素 樣 生 長 因 子 -K I G F -1) 信 號 通 路 中 ，酪 氨 酸 激 酶 和 磷 酸 酶 將 信 號 從 細 胞 表 面 的 配 體 -結 合 受 體 轉 導 至 下 游 耙 標 (Taniguchi et al. ，2006) 。

傳 統 的 檢 測 蛋 白 質 P T M 的 方 法 包 括 E d m a n 降 解 法 和 薄 層 色 譜 法 (thin-layer chromatography,T L C ) 。 然 而 這 些 方 法 會 有 一 些 限 制 。例如 ，需 要 大 量 起 始 材 料 , 并 且 對 于鑒 定 罕 見 的 或 亞 化 學 計 量 的 P T M 無 能 為 力 。 由 于 大 多 數 P T M 都 會 導 致 與 之 對 應 的 被修 飾 蛋 白 質 的 質 量 改 變 , 因 此 ，能 夠 檢 測 蛋 白 質 分 子 質 量 改 變 的 方 法 ，即 基 于 質 譜 的 蛋 白質 組 學 ，目 前 已 普 遍 用 于 鑒 定 P T M 。一 些 P T M ，如 磷 酸 化 和 甲 基 化 , 會 增 加 蛋 白 質 的 質量 ，然 而 另 外 一 些 P T M ，像 信 號 肽 的 去 除 或 二 硫 鍵 形 成 ，則 使 蛋 白 質 的 質 量 減 少 。依 賴 于所 使 用 的 質 譜 設 備 , 本 章 所 介 紹 的 蛋 白 質 組 學 方 法 具 有 髙 靈 敏 度 優 勢 ，能 夠 以 小 于 百 萬 分
之 一（< 1 p p m ，part per million) 的 精 確 度 測 量 分 子 質 量（M a k arov et al. , 2006; L u etal. ，2008 ; Scigelova and M a k a r o v , 2006)。設 備 制 造 商 和 理 論 研 究 者 一 直 致 力 于 提 升 儀器 技 術 以 及 發 展 新 的 P T M 鑒 定 方 法（Garcia et al. ，2005; 2007)，如 近 期 這 一 領 域 內 的研 究 進 展 包 括 ，斷 裂 肽 段（fragmentation of peptide) 的 電 子 轉 移 解 離 法（electron transfer
dissociation,E T D ) 和 能 夠 精 確 測 量 未 消 化 蛋 白 質 質 量 的 動 態 檢 測 器（C o o n et al. , 2004;Mikesh et al. ，2006; Pitteri et al. ，2005; Syka et al. ，2004)。

能 夠 選 擇 性 分 離 可 能 發 生 P T M 的 蛋 白 質 或 多 肽 的 富 集 方 法 可 以 與 基 于 質 譜 的 蛋 白質 組 學 方 法 聯 用 。這 些 富 集 手 段 可 以 減 少 罕 見 修 飾 所 帶 來 的 問 題 。可 將 眾 多 可 用 的 親 和富 集 策 略 主 要 分 為 兩 類 : 第 一 類 是 用 抗 體 識 別 一 個 特 定 P T M 或 者 帶 有 特 定 修 飾 的 肽 段 ,如 抗 磷 酸 化 酪 氨 酸 的 抗 體 可 用 于 富 集 含 有 磷 酸 化 酪 氨 酸 殘 基 的 肽 段（Blag0ev et al. ，2004 ; R u s h e t a L ，2005 !Zhang etal. ，2005); 第 二 類 方 法 基 于 固 定 化 樹 脂 對 某 種 修 飾 的化 學 親 和 作 用 ，包 括 針 對 磷 酸 化 的 固 定 化 金 屬 親 和 色 譜 法（I M A C ) 和 針 對 糖 基 化 的 凝 集素 色 譜 法 (Ito et al. ，2 0 0 9 ) ，這 些 方 法 已 經 廣 泛 使 用 并 仍 在 發 展 之 中 。

另外 一 個 能 夠 有 效 鑒 定 P T M 并應用普遍的蛋白質組學方法是二 維 凝 膠電泳（twodimensional gel electrophoresis，2I> GE)。 P T M 能夠改變蛋白質的等電點及其在 2D 凝膠中的電泳遷移率。如果通過 2D 凝膠電泳發現了不同細胞種類或生長條件之間的這種改 變 ，就可以將該蛋白質分離出來，并通過測序鑒定它的 P T M 。例如, 一個蛋白質不同的磷酸化將改變它的等電點，并且可能會導致電荷異質性。這種發生不同磷酸化的蛋白質會表現為一串具有不同的等電點但是相似的分子質量的2D 斑點。這種形式有時被形象的比喻為「項鏈上的一串珍珠」。多年來已經發明了許多揭示蛋白質P T M 的特定蛋白質染色方法 (Ge et al. ，20〇4 ; Patton, 2002)，包括直接檢測膠中磷蛋白和糖蛋白的熒光方法（G e et al. , 2004; Steinberg et al. ，2001; Schulenberg et al. ，2003a ,b , 2004)。 對于這 些 2D 斑 點 ，蛋 白 質 可 被 膠 內 消 化 ，然 后 回 收 的 肽 段 通 過 質 譜 分 析 ，以 鑒 定 、驗 證 并 繪 制可 能 的 P T M 圖 譜（H a y d u k et al. ，2004; Steinberg et aL , 2003)。然 而 用 2D 凝 膠 電 泳法 鑒 定 P T M 并 非 易 事 ，因 為 修 飾 肽 段 的 回 收 和 分 析 常 常 會 出 現 很 多 問 題 。

蛋 白 質 組 學 已 有 多 種 工 具 來 量 化 蛋 白 質 及 其 特 定 P T M 的 絕 對 豐 度 或 中 度 相 對 豐 度(Paoletti and W a s h b u r n , 2006)。 目 前 已 經 發 展 多 種 體 內 和 體 外 標 記 方 法 ，可 利 用 質 譜定 量 P T M ，并 精 確 測 量 細 胞 事 件 中 P T M 的 變 化（Goodlett et al. , 2001; Gygi et al. ，1999; O d a et al. ，1999; O n g et al. , 2002; Ross et al. , 2004; Zhang et al. ，2005)。P T M 的 定 量 對 于 研 究 某 一 特 定 P T M 的 生 物 學 意 義 有 著 至 關 重 要 的 作 用 ，這 是 因 為 簡 單的 鑒 定 一 個 修 飾 的 存 在 與 否 ，有 時 并 不 足 以 提 供 足 夠 的 生 物 學 信 息 來 說 明 它 的 重 要 性 。Matthies M a n n 及 其 同 事 的 一 項 研 究 發 現 ,H e L a 細 胞 中 1 4 % 已 鑒 定 的 磷 酸 化 位 點 , 在表皮
生 長 因 子 的 刺 激 下 增 加 了 至 少 2 倍, 這說明了 P T M 定 量 的 重 要 性 (Olsen et al. ，2006)。

然而，在使用基于質譜的蛋白質組學來鑒定 P T M 時, 需考慮到某些局限性。某些P T M ，如絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸的磷酸化，以 及 O-糖基化或] V-糖基化是不穩定的，因此在樣品制備過程中維持這些修飾比較困難。而且如果沒有采用有效的分離方法, 未修飾肽段或蛋白質會影響質譜分析。當樣品中大部分蛋白質分子都未被修飾時，P T M 亞化學計量的檢測將會異常艱難。對于質譜分析，有不同廠家的眾多儀器可供選擇，它們均有各自的優點和缺陷。通常的方法是將蛋白質消化為肽段，進而直接分析肽段。一個給定肽段的修飾將會降低離子化效率，從而會影響質量譜圖，并阻礙序列鑒定。另 外 ，由于許多肽段包含眾多潛在P T M 的氨基酸修飾位點，因此有時很難判斷到底是哪一個氨基酸發生了修飾。除此之外，當使用碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID) 來斷裂含不 穩 定 PTM (如磷酸化和糖基化) 的肽段時，不穩定的基團將會發生消除反應，從而產生中性丟失碎片（neutral loss fragment)。 這個反應在能量上比酰胺鍵斷裂更有利。如此產生的質量譜圖通常不能得到足夠的測序離子，因而無法準確鑒定肽段或者被修飾的氨基酸。最后，稀 有 P T M 的檢測非常有挑戰性, 它的鑒定通常需要非常高靈敏度的質譜手段或者 P T M 富集策略。

對于使用任何一種質譜方法得到的蛋白質組學數據, 需要格外關注所獲得信息的豐度和復雜程度。典型的，在液相色譜和串聯質譜聯用分析消化蛋白質的異質混合物時，能夠產生成百上千萬的譜圖。在所獲得的質譜圖中，對于觀測到的峰有近乎無窮的 P T M和相應加合肽的可能組合。大量的數據需要一種「 in silico」蛋白質數據庫檢索算法，從而將基因組數據庫得到的理論譜與實驗所得到的觀測譜相匹配。搜索實驗譜鑒定 P T M時需要了解一些潛在修飾特性的「先驗」知識，這是因為搜索時由于計算資源有限而限制了可以納人考慮的修飾數量。例如，當僅考慮絲氨酸(S )、蘇氨酸(T )、酪氨酸(Y ) 的磷酸化時(這種磷酸化增加80 D a 標稱質量），所需的計算資源，比起搜索同樣的數據集但是沒有質量漂移的情況要高出指數數量級。這種情況的發生是由于算法不僅需要考慮沒有任何修飾的肽段，還不得不考慮當蛋白質序列中S 、T 、Y 殘基發生修飾或未發生修飾的所有情況。為解決這個問題，許多團隊一直致力于發展算法軟件，用來從質譜數據中鑒定未能預料的 P T M ( C h a l k l e y et al. ,2008; H a n s e n et al.，2001，2005; T a n g et al. ， 2005)。這些算法可以計算推測的肽段序列和實驗M S /M S 前體間的質量差異，并將質量漂移定位到肽段的序列位置（Hansen et al. ，2005)。

本章主要針對研究最頻繁的一些修飾，著重介紹質譜和蛋白質組學領域的現存和新出現的鑒定P T M 的技術方法，但這些方法的應用并不僅限于本章所介紹的內容。我們也會與討論修飾類型一樣，對于串聯質譜法中可用的技術做一概述，這些技術會影響實驗者鑒定特定P T M 的能力。前期對于 P T M 的整體分析研究凸顯了各種各樣的困難—這些困難來自于從大規模篩選所得到的大批數據中分辨可用信息。本章會給出一個工作流程示例，來幫助研究者發展最適用于研究他們當前關心的問題和可用資源的方法。除此之外，我們將概述許多可用方法來進一步定量PT M 。很 明顯，可供研究者選擇的資源和技術越來越多，這些資源和技術中很多都不僅僅可用來鑒定P T M 。

二、用 于 鑒 定 P T M 的富 集 技 術

2.1 磷酸化

絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的可逆磷酸化也許是研究最為深人的 PT M 。蛋白質磷酸化信號網絡介導細胞對與不同的應激因子、生長因子、細胞因子以及細胞間相互作用作出響應。憐酸化還影響多種細胞進程，如增殖、凋亡 、遷移 、轉錄和蛋白質翻譯（W hite，2008)。 在腫瘤、自身免疫疾病、代謝紊亂和傳染性疾病中都涉及蛋白激酶和磷酸酶的異常調節（Blume-Jensen and H unter， 2001; Gatzka and Walsh， 2007; Sirard et al. ， 2007;T aniguchietaL ,2006)。一個磷酸化反應事件就會對細胞進程產生劇烈影響。例如, 養分剝奪、環境應激、某 些 小 R N A 病毒感染都會激發 eIF4E-結合蛋白的去磷酸化，進而導致 eIF4E-結合活性顯著提高, 從而抑制翻譯(Gingras et al. , 2001)。

傳統的鑒定磷酸化位點的手段包括使用32P-標 記的 ATP(32P-Iabeled ATP) 或磷酸共培養細胞。磷酸化蛋白質組會攝取生長培養基中的放射性磷, 繼而通過一些手段，如 2I>GE或高效液相色譜 (HPLC) 檢測具有放射性的蛋白質。分離得到的蛋白質會被水解。所得的磷酸肽在 TLC 板中分離，隨后利用 Edman 降解法進行測序。然而，這些方法非常費時，并需要大量相對純的磷酸肽，而且必需使用大量放射性材料 (McLachlin and Chait，2001)。

由于以上缺陷，基于質譜的蛋白質組學迅速崛起，成為鑒定磷酸化的首選方法。近期—個 蛋 白 質 組 研 究 通 過 比 較 大 腸 桿 菌 co「）、乳酸菌< X ac(ococo? Zac汾）和枯草 芽 孢 桿 菌 )發現, 在介導碳代謝作用的糖酵解途徑中的幾乎所有的酶都在不同的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基發生了磷酸化 (SouH et al. , 2008)。 有趣的是，他們還發現檢測出的磷酸化位點表現出的進化保守性遠遠高 于 一 級 序 列（Soufi et al. ，2008 ) 。 另一個研究小鼠肝臟磷酸化蛋白質組的結果發現，雖然鑒定出的許多磷酸化位點在 Swiss-P ro t數據庫中已有注釋(Pan et al. ， 2008)，然而鑒定位點中半數以上是新的，說明小鼠磷酸化蛋白質組中可能仍有許多磷酸化位點有待發現(Pan et al. , 2008)。

質譜法能夠從復雜的蛋白質混合物中鑒定出特定的磷酸化位點，但是這種方法也確實會有一些問題，如在樣品量有限、樣品復雜度高或樣品中蛋白質濃度動態范圍廣的蛋白質組學應用中時(White, 2008)。而將這些困難更為復雜化的是，磷酸化通常是亞化學計量 的 ，因 此 一 個 蛋 白 質 來 源 的 磷 酸 肽 的 濃 度 比 其 他 肽 段 的 濃 度 都 要 低 。大 量 未 修 飾 肽 段抑 制 了 質 譜 對 憐 fe膚 的 反應。. 這 個 現 象 會 導 致 目 的 憐 酸 膚 檢 測 信 號 的 缺 失（McLachlinand C h a k , 2001)。這 可 以 通 過 多 種 富 集 技 術 減 少 與 P T M 變 體 相 關 的 未 修 飾 肽 段 含 量 ，從 而 減 少 這 種 抑 制 性 假 象 (suppression artifact) 。

其 中 一 種 應 用 于 憐 酸 化 鑒 定 的 帛 集 技 術 是 使 用 強 陽 離 子 交 換（strong cationexchange,S C X )樹脂來選擇性分離磷酸肽。研究發現, 在 p H 小 于 2.6 時 ，胰蛋白酶消化的磷酸肽不能被S C X 顆 粒 保 留（BeausoleiletaL , 2004)，這可能是由于磷酸基團荷載了更 多 的負電特性。 S C X 柱的流穿液可以用反相(R P )色譜柱分離，并用質譜分析 (Lim andKassel， 2006)。這種將磷酸肽從未修飾的相似物中分離出來的方法, 可以幫助減輕上述的質譜檢測中的抑制問題。這種富集技術的優勢在于既能在線（on— line)也能離線（offline)分離 。而劣勢之一是它依賴于 S C X 樹脂與磷酸肽的不可結合性 ，這點與其他一些通過與磷酸化殘基結合，并因而能夠選擇性地富集磷酸肽的方法不同。

固定化金屬親和層析 (I M A C )是一種運用最為普遍的從復雜的消化蛋白質混合物中選擇性分離磷酸肽的方法。這種方法通常利用一種金屬螯合介質來結合三價金屬離子，如 Fe34或 G a 3+ ( S y k o r a et al. ，2007)。這種帶電樹脂結合磷酸肽后, 先用洗滌液(通常是乙酸溶液)去除未修飾肽段，接下來可用磷酸鹽緩沖液或者高p H 溶液洗脫磷酸肽。洗脫
的磷酸肽可直接過R P 柱脫鹽用于下一步質譜分析，也可離線進行進一步富集或其他操作 。 然 而 ，I M A C 法確實存在一些復雜因素。如果攜帶多磷酸化位點的磷酸肽豐度較大，它們會覆蓋 I M A C 樹脂，導致單磷酸化或雙磷酸化的磷脂肽保留較少。并且, 其他酸性肽段也會與 I M A C 柱發生親和作用, 從而與鱗酸肽一起被富集。這一問題在應用于極度復雜的肽混合物(如全細胞提取物) 時會更加嚴重。為了避免該問題, 許多研究者試圖通
過化學還原反應來甲基酯化酸性殘基和C 端 (Ficarro et al. ，2 0 0 2 ) 。 然而 ，研究發現甲基酯化反應并不是定量的（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。 這 樣 ，目的肽段的存在形式將是修飾過 、部分修飾或未修飾3 種 。這增加了混合物的復雜程度, 給定肽段的相對量實際上減少了（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。

另外一種類似于IM A C法的方法，使用二氧化鈦(TiO2)作為金屬螯合樹脂的替代物(Larsen et al.，2005; Pinkse et al. ，2004; Thingholm et al. ， 2006)。正如 IM A C法中修飾肽段的磷酸基團與H 價金屬有親和力一樣，在酸性條件下磷酸基團同樣與二氧化鈦分子有親和作用（Larsen et al.，2〇05; Pinkse et al. ，2004 ; Thingholm et al. ， 2006)。通過轉換到高P H 緩沖液中，磷 酸 肽 可 以 從 TiO2基質中洗脫下來。這種方法的優點在于 ，柱制備時間短，比 IM A X樹脂洗滌循環數少。研究表明, 盡管這兩種方法使用同樣的親和原理，但是它們卻具有互補性—兩種方法分別能夠檢測到不同磷酸肽（Cantiri et
al.，2007)。 IM A C 的特點是針對多磷酸化位點的肽段具備高親和力，而二氧化鈦則優先結合單憐酸化多肽 (Bodenmiller， e ta l. ，2007)。這表明在一個研究中同時使用兩種方法能夠最大限度覆蓋憐酸化蛋白質組。

另外一類磷酸肽富集方法則利用化學方法在磷酸化位點引入親和標簽（Goshe etal.，2001; Oda e ta l. ， 2001)。 該方法利用堿性環境，通過卩-消除反應從磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基中去除 H 3PO4 (McLachlin andChait，2003; Oda et al. ， 2001); 進而通過
Michael-like加 成 反 應 ，將 一 個 二 巰 基 化 物 加 到 雙 鍵 上 ; 接 著 用 結 合 了 生 物 素 的 烷 化 試 劑處 理 巰 基 ，得 到 的 生 物 素 化 肽 段 可 利 用 親 和 素 柱 色 譜 來 富 集（圖 40.1) (McLachlin andChait，2003)。這 個 方 法 的 一 個 難 點 在 于 ，由 于 生 物 素 與 親 和 素 間 的 高 親 和 力 ，回 收 標 簽化 的 肽 段 成 為 問 題 。并 且 ，這 個 方 法 能 夠 富 集 磷 酸 絲 氨 酸 、磷 酸 蘇 氨 酸 ，卻 無 法 富 集 磷 酸酪 氨 酸 。片 消 除 反 應 后 接 michael 加 成 反 應 同 樣 會 改 變 O 聯 片 JV-乙 酰 葡 糖 胺（O-

G l c N A c )修飾，這樣會與磷酸化競爭富集作用 (W e lls e t al. ，2002)。最 后 ，在 , 消 除 反 應的堿性環境下，會發生不需要的副反應，導致對肽段質量造成無法預料的影響，從而使下游的肽段質譜鑒定變得更加困難。

在質譜過程中，必須考慮磷蛋白的特定化學性質。發 生 在 S 或 T 氨基酸上的磷酸化是不穩定的。傳 統 的 斷 裂 方 法 會 導 致 磷 酸 絲 氨 酸 和 磷 酸 蘇 氨 酸 殘 基 發 生 H 3PO4 , 或HPO3選擇性中性丟失，并且先于肽鍵的斷裂絕大部分憐酸化修飾都發生了片消除反應，僅 有 一小部分憐酸化修飾伴隨著肽鏈斷裂而保留下來（Bennett et al. , 2002; L e e et al. ，2001; M a et al. ，2001)。這會造成質量譜圖中包含的測序離子變少，而且通常這些離子強度會變弱。最終較低的信噪比（圖 40. 2)會妨礙對肽段序列的解釋。盡管磷酸酪氨酸也可能丟失磷酸基團，但是很少像磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基一樣產生強烈的中性丟失離子。一些質譜儀使用 E T D 避免這種中性丟失問題，產生的譜圖既適合于序列分析也適合于憐酸化殘基測定。我們在介紹用于蛋白質組學鑒定P T M 的設備時，將會進一步討論這種斷裂方法。

另外，中性丟失偽跡(neutral loss artifact)也 可 為 研究人員提供便利。中性丟失跡象是肽段中含有磷酸化位點的一個顯著的指示信號。質譜中觀察到的中性丟失峰通常由于其形成的優先性而具有高強度。因此，如果對于+ 1 價電荷肽段，發現前體離子丟失98 m /z(H3P4)或 80 m/z (H P0 3)，可以推斷在肽段序列中存在一個磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘 基 。 現代質譜儀可以監測這種質量丟失。離子阱質譜儀能夠分離中性丟失碎片，并開始另一輪 斷 裂（MS3 scan) (Beausoleil et al. ，2004; Gruhler et al. ，2005; Olsen and Mann， 2004 ; Ulintzetal. ，2009)。 這個附加分析步驟的結果就是提供了額外的序列覆蓋 范 圍 ，從而幫助鑒定磷酸肽，并 將 P T M 匹配到特定氨基酸。另外 一 種 MS3? 描 的替代方 法就是運用于離子阱質 譜 儀 的磷酸肽斷裂「Pseudo MS」」或稱多級活化（M SA)(SChro e d e re ta l. ，2004)。這種方 法 在 M S /M S掃描肽段產生的中性丟失產物引入了 C I D 。 中性丟失離子產生的離子與初始MS/M S 產物離子一起被捕獲得到復合譜。在 M S A 中 ，中性丟失離子被轉變成一些結構上有益的碎片離子，這種離子在數據庫搜索算法中的分數將會出現升高現象(Schroeder et al. ，2004; Ulintz et al. ，2009)。

磷 酸 化 給 肽 段 引 入 一 個 負 電 荷 ，這 也 將 影 響 質 譜 的 分 析 。當 陽 離 子 模 式 下 操 作 時 ，這個 負 電 荷 會 減 弱 質 譜 儀 響 應 (McLachlin and Chait，2001)，這 會 導 致 譜 圖 質 量 變 差 ，并 使磷 酸 肽 鑒 定 更 加 困 難 。而 且 ，增 加 的 負 電 荷 會 降 低 質 譜 分 析 前 蛋 白 質 混 合 物 制 備 時 的 蛋白 質 水 解 作 用 。然 而 需 要 說 明 的 一 點 是 ，Harnio Steen與 同 事 發 現 , 在 使 用 電 噴 霧 電 離(electrospray ionization,ESI)選 擇 性 研 究 磷 酸 肽 時 , 沒 有 證 據 能 證 明 電 離 程 度 /探 測 效 率會 降 低（Steen et al. ，2006)。

作 為 一 種 替 代 方 法 ，Steve C a r r 和 同 事 提 出 了 前 體 離 子 掃 描 (precursor ion scanning)技 術 ，可 以 用 來 避 免 陽 離 子 模 式 運 行 質 譜 時 產 生 的 一 些 問 題 (Carr etal. ，1996)。 串 聯 質譜 是 在 陰 離 子 模 式 下 運 行 ，并 且 磷 酸 化 殘 基 會 產 生 特 征 性 的 碎 片 :P O 3— 大 小 為 一 79 D a ，P O 2— 大 小 為 一 63 D a 。當 在 前 體 離 子 掃 描 中 發 現 以 上 事 件 中 任 何 一 個 時 ，將 會 對 前 體 離子 進 行 M S /M S 檢 測（Z a p p a c o s t a e t a L，2006)。這 種 方 法 檢 測 磷 酸 肽 時 比 陽 離 子 模 式質 譜 靈 敏 度 更 高 (Carret a L ，1M 6) 。然 而 ，陰 離 子 譜 解 釋 較 為 困 難 ，因 此 并 未 得 到 廣 泛

2.2 糖基化

糖 基 化 是 一 種 常 見 的 P T M , 并 且 已 經 證 明 能 夠 影 響 酶 的 活 性 、蛋 白 質 定 位 、穩 定 性 、信 號 轉 導 、細 胞 黏 附 和 蛋 白 質 相 互 作 用 (Spiro, 2002k 目 前 已 經 發 現 在 腫 瘤 惡 性 轉 化 和腫 瘤 發 生 時 ，生 物 體 液 中 蛋 白 質 和 細 胞 表 面 的 糖 基 化 模 式 會 發 生 變 化 (Durand and Seta,2000)。一 個 蛋 白 質 組 中 存 在 著 大 量 糖 基 化 修 飾 。O- 糖 基 化 蛋 白 質 是 在 絲 氨 酸 和 蘇 氨 酸位 點 發 生 修 飾 , 而 C -糖 基 化 則 靶 向 于 色 氨 酸 ,N-糖 基 化 靶 向 天 冬 酰 胺 。發 生 N -糖 基 化 的蛋 白 質 會 有 一 些 共 同 之 處 ，如 核 心 結 構 、一 些 去 除 N 聯 結 構 的 酶 ，并 且 普 遍 分 布 在 細 胞 膜胞 外 區域（Medzihradszky, 2005 ) 。 N-糖 基 化 位 點 有 一 個 確 定 的 共 有 序 列（consensussequence) ,即N-X-S/T ,X 是除脯氨酸之夕卜的任何氨基酸(Pless and Lennarz, 1977)。另— 個 靶 向 絲 氨 酸 和 蘇 氨 酸 殘 基 的 修 飾 是 O聯β-N-乙 酰 葡 糖 胺 (O G k N A c ) 。 Gerald Hart和 同 事 開 創 了 這 種 動 態 核 質（nucleocytoplasmic) P T M 研 究 的 先 河（Holt and Hart,1986)。發 生 這 種 修 飾 的 許 多 靶 向 蛋 白 質 也 能 夠 發 生 磷 酸 化 修 飾 ，推 測 這 種 修 飾 對 蛋 白質 磷 酸 化 修 飾 會 有 拮 抗 作 用 ( A h m a d et aL , 2006)。

質 譜 鑒 定 磷 酸 化 的 一 些 問 題 同 樣 也 出 現 在 糖 基 化 研 究 中 。相 對 未 被 修 飾 的 蛋 白 質 ，這 些 修 飾 在 豐 度 上 都 傾 向 于 亞 化 學 計 量 。蛋 白 質 糖 基 化 和 O G l c N A c 修 飾 在 質 譜 中 都 是不 穩 定 的 ，通 常 產 生 低 質 量 的 測 序 譜 圖 。盡 管 N -糖 基 化 的 一 種 共 有 序 列 已 經 非 常 明 確 ，然 而 在 體 內 僅 有 部 分 含 有 這 一 共 有 序 列 的 蛋 白 質 發 生 了 糖 基 化 。

上 面 提 到 的 可 應 用 于 磷 酸 化 分 析 的 替 代 的 肽 段 斷 裂 方 法 同 樣 適 用 于 糖 基 化 。能夠解決 糖 基 化 低 豐 度 問 題 的 富 集 技 術 也 已 存 在 (Mechref e t a L ，2008)。使 用 凝 集 素 親 和 層 析(lectin affinity chromatography) 可 選 擇 性 地 富 集 糖 蛋 白 。凝 集 素 是 一 種 高 度 特 異 的 糖 結合 蛋 白 ，并 能 夠 與 固 相 基 質 偶 聯 . 偶 聯 好 的 樹 脂 與 復 雜 的 水 解 蛋 白 質 混 合 物 混 合 ，通 過 洗滌 、洗 脫 即 可 分 離 到 適 用 于 蛋 白 質 組 學 分 析 的 糖 肽 組 分 。 O G l c N A c 可 用 P-消 除 法 及 后續 的 Michael加 成 二 硫 蘇 糖 醇 或 生 物 素 -戊 胺 (biotin pentylamine)反 應 來 富 集 ，這 種 方 法類 似 于 前 文 磷 酸 化 中 所 詳 述 的 內 容 (Wells et al. ，2002)。另 一 種 方 法 是 N -聯 糖 肽 固 相提 取 法（solid-phase extraction of N-Iinked glycopeptides，S P E G ), 這 種 方 法 使 用 肼 化 學法 (hydrazine chemistry)直 接 將 糖 肽 添 加 到 固 相 支 架 上 (Tian et al. ，2007)。洗 漆 后 ，用肽 -N -糖 苷 酶 (peptide-iV-glycosidase)處 理 來 洗 脫 糖 肽 。凝 集 素 親 和 層 析 色 譜 法 的 優 點 在于 ，能 夠 結 合 的 糖 蛋 白 范 圍 非 常 廣 , 通 過 不 同 糖 苷 酶 洗 脫 能 夠 有 效 分 離 不 同 類 型 的 糖 肽(Yang and H a n c o c k , 2005)。也 有 專 門 的 柱 子 ，所包含 的 凝 集 素 特 異 地 結 合 一 定 類 型 的糖 連 接 結 構 ，能 提 供 更 高 不 同 程 度 的 選 擇 性 富 集（Tian et al. , 2007)。需 要 說 明 的 是 , 使用 糖 苷 酶 詵 脫 糖 肽 是 從 肽 段 上 切 下 寡 糖 ，這 使 得 原 本 可 以 通 過 質 譜 獲 得 的 結 構 信 息 丟 失 。但 是 這 卻 大 大 簡 化 了 數 據 分 析 過 程 , 因 為 糖 基 化 的 天 然 結 構 非 常 復 雜 ，并 且 以 多 變 的 聚 糖基 化 (polyglycosylated)形 式 存 在 。

2.3 泛素化和蘇素化修飾

泛 素 是 一 個 由 7 6 個 氨 基 酸 組 成 的 蛋 白 質 ，能 夠 通 過 其 C 端 的 甘 氨 酸 殘 基 結 合 于 底物 賴 氨 酸 的 α氨 基 基 團 。這 個 過 程 需 要 E 1 、E 2 、E 3 酶 共 同 參 與（Fang and W e i s s m a n ,2004)。泛 素 的 序 列 含 有 7 個 賴 氨 酸 , 這 7 個 賴 氨 酸 能 夠 被 泛 素 化 選 擇 ，從 而 形 成 泛 素 鏈(Fang and W e i s s m a n ，2004)。被 進 一 步 泛 素 化 的 泛 素 分 子 內 部 的 賴 氨 酸 能 夠 決 定 泛 素化 修 飾 的 生 物 學 意 義 。例 如 ，K 4 8 連 接 的 泛 素 鏈 能 引 導 被 修 飾 蛋 白 質 經 由 26S 蛋 白 酶 體降 解 , 而 K 6 3 的 連 接 形 式 則 參 與 到 D N A 損 傷 反 應 、蛋 白 質 運 輸 、N F -KB 信 號 通 路 的 信 號轉 導 等 過 程 (Ikeda and Dikic，2008; Pickart and F u s h m a n ，2004)。泛 素 化 蛋 白 的 周 轉 非常 迅 速 ，這 導 致 這 種 P T M 處 于 低 穩 態 水 平 (Peng etal. ，2003)。而 使 泛 素 化 位 點 的 預 測更 加 復 雜 化 的 是 , 幾 乎 沒 有 數 據 能 夠 證 明 泛 素 化 存 在 一 個 通 用 基 序 (SUter etal. , 2008)。

另 一 個 類 似 泛 素 的 小 蛋 白 質 分 子 就 是 蘇 素 化 修 飾 蛋 白（S U M O ) 。盡 管 兩 種 蛋 白 質一 致 性 僅 1 8 % , 但 是 它 們 的 三 維 結 構 卻 有 相 似 性 (Bayer et al. ，1998)。蘇 素 化 修 飾 和 泛素 化 共 享 相 同 的 E 1 、E 2 、E 3 酶 , 將 S U M O 分 子 結 合 到 一 個 保 守 基 序 內 部 的 氨 基 酸 殘 基上 。蘇 素 化 修 飾 優 先 發 生 在 女 K -X -E 序 列 中 ，^ 代 表 一 個 疏 水 性 氨 基 酸（Rodriguez etal. ，2001)。蘇 素 化 修 飾 靶 向 于 大 量 參 與 各 種 不 同 細 胞 進 程 的 蛋 白 質 , 如 轉 錄 調 節 、核 小體 形 成 、細 胞 核 孔 復 合 物 和 D N A 修 復 (Melchior et a L ，2003)。蘇 素 化 修 飾 能 夠 與 泛 素化 競 爭 ，從 而 阻 止 蛋 白 質 被 降 解 , 穩 定 細 胞 所 需 的 關 鍵 的 酶 。這 種 修 飾 還 能 夠 將 蛋 白 質 進行 特 定 的 細 胞 定 位 , 如 核 孔 復 合 體 (M anza et al. ，2004)。

目 前 已 經 發 展 了 一 些 有 效 的 富 集 方 法 來 分 離 泛 素 化 和 其 他 蘇 素 化 修 飾 的 蛋 白 質 。其中 最 成 功 的 一 種 是 在 泛 素 及 類 泛 素 分 子 的 基 因 序 列 中 整 合 人 氨 基 末 端 表 位 標 簽（aminoterminal epitope t a g K P e n g et al. ， 2003; Tagwerker et al. ， 2006)。 目 前 已 成 功 使 用 了多 組 氨 酸 標 簽 ，以 及 由 多 組 氨 酸 標 簽 和 F L A G 標 簽 組 成 的 串 聯 親 和 標 簽 (C h a n g , 2006)。串 聯 親 和 標 簽 純 化 方 法 能 夠 減 少 假 陽 性 的 出 現 率 ，但 是 無 法 完 全 消 除 。使 用 抗 泛 素 類 分子 的 抗 體 是 一 種 選 擇 , 但 是 這 種 抗 體 應 用 于 免 疫 沉 淀 中 以 分 離 泛 素 蛋 白 質 的 方 法 仍 在 發展 中 。也 可 利 用 泛 素 結 合 蛋 白 質 以 避 免 一 些 由 抗 體 和 親 和 標 簽 引 起 的 問 題 (Kirkpatricketal. ，2005)。表 位 標 簽 在 簡 單 模 式 系 統 ，如 釀 酒 酵 母 (Sacc/iarom^ ycescereTO’ h a e ) 中應用非 常 方 便 ，因 為 編 碼 未 標 簽 泛 素 的 多 個 基 因 可 被 刪 除 ，使 得 細 胞 中 僅 有 含 表 位 標 簽 的 泛 素分 子 。

事 實 上 ，泛 素 化 和 蘇 素 化 修 飾 都 是 蛋 白 質 類 P T M , 可 采 用 多 種 質 譜 的 手 段 鑒 定 靶 蛋白 。當 胰 酶 消 化 泛 素 化 蛋 白 質 時 ，部 分 泛 素 分 子 被 切 割 下 來 。剩下胰 蛋 白 酶 消 化 片 段 的泛 素 化 位 點 上 含 有 2 個 甘 氨 酸 殘 基 ，通 過 一 個 異 肽 鍵 與 賴 氨 酸 相 連（P eng et a L ，2003)。這 一 肽 段 導 致 在 賴 氨 酸 殘 基 處 產 生 了 一 個 114 D a 的 標 稱 質 量 漂 移 ，而 且 由 于 胰 蛋 白 酶 不能 識 別 修 飾 過 的 賴 氨 酸 ，因 而 還 丟 失 了 一 個 胰 蛋 白 酶 酶 切 位 點 。對 于 其 他 蘇 素 化 修 飾 也有 各 自 特 征 性 的 質 量 漂 移 , 見 表 40. 2(D enis〇n et al. ， 2005)。當 搜 索 譜 圖 尋 找 該 類 型 的潛 在 P T M 時 ，可 以 考 慮 這 些 特 性 。

使 用 基 于 質 譜 的 蛋 白 質 組 學 方 法 研 究 此 類 P T M 的 一 個 顯 而 易 見 的 問 題 就 是 質 量 S移 (mass shift) 的 冗 余 ，如 表 40. 2 所 示 。從 一 個 肽 的 鑒 定 譜 圖 中 可 能 無 法 分 辨 這 是 泛 素化 修 飾 還 是 蘇 素 化 修 飾 ，因 為 這 兩 種 類 型 都 能 在 賴 氨 酸 殘 基 處 增 加 114 D a 。蘇 素 化 修 飾會 使 肽 段 質 量 增 加 較 大 ，這 會 影 響 肽 段 的 電 離 ，減 弱 電 離 效 率 。發 生 蘇 素 化 修 飾 肽 段 會 使結 果 譜 圖 變 復 雜 ，甚 至 無 法 解 讀 。 一 個 實 驗 室 發 展 了 蘇 素 化 修 飾 模 式 識 別 軟 件（S U M -m 〇n ) ，來 尋 找 由 復 雜 P T M 產 生 的 碎 片 離 子 模 式 ，并 鑒 定 修 飾 肽 段 及 其 相 應 的 修 飾 位 點

三、蛋白質的硝化修飾

酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸側鏈的硝化與亞硝化作用構成了蛋白質硝化PT M 的主要部分。這些加成反應由發育、氧化應激及衰老過程中產生的活性氮介導。活性氮的增加是由一氧化氮和活性氧的過度反應或調控紊亂造成的（Yeo et al.，2008)。活性氮和活性氧能夠靶向于DNA、脂類和蛋白質 (Barnes e ta l.，2003)。根據產生的自由基，活性氮將會優先與酪氨酸殘基反應，形成3-硝基酪氨酸或3-亞硝基酪氨酸(Beckman et al.， 19如\ 酪氨酸的硝化修飾的特性也許可通過產生的加合物得到最好的描
述。研究表明，酪氨酸硝化水平的增加與衰老相關的神經退行性疾病有關 ，而且可以作為氧化應激的一個生物標志物(Yeo et al.， 2008)。 在正常生理條件下，硝化酪氨酸加合物的形成會被存在的還原劑, 如谷胱甘肽阻止(C henet al., 2004)。 酪氨酸硝化會將結合的羥基的 PKa 從 10.1改 變 至 7. 2, 并導致被修飾蛋白質結構和功能上的改變(Sokolovsky et al., 1967)

目前沒有能夠直接分離硝化多肽和蛋白質的選擇性富集策略。這 可 能是由于這種PT M 的一氧化氮基團的化學活性較低。在有連二亞硫酸鈉（dithionite，DTH)存在的還原環境中，這些相對惰性的部分可被轉換成胺類, 從而易于與標簽基團反應（Yeo et al.，2008)。隨 后 ，標簽化的多肽可通過蛋白質組學方法選擇性分離和分析。 目前應用最普遍的鑒定蛋白質硝化修飾的方法，是將2I > G E 與某一給定的硝化加合物的特異性抗體的免疫印跡分析結合 (Zhan and Desiderio, 2004)。 蛋白質通過2D —— G E 實驗被 解 析 ，并通過適當抗體直觀的觀察到發生此種修飾的蛋白質。進而將免疫印跡陽性的斑點從膠上切 離 ，消化后利用質譜進行鑒定 (Zhan and Desiderio, 2004) 。 對于酪氨酸硝化修飾，在搜索質譜數據鑒定加合位點時，可根據加合物的不同進行鑒別: 硝化作用產生一個 45 D a 的標稱質量漂移，而亞硝化作用產生一個 29 D a 的標稱質量漂移。

四、甲基化和 乙 酰 化

賴 氨 酸 和 精 氨 酸 的 甲 基 化 修 飾（+ 14 D a ) 以 及 賴 氨 酸 乙 酰 化 修 飾（+ 4 2 D a ) 這 兩 種P T M 類 型 在 組 蛋 白（histone) 密 碼 中 的 作 用 正 在 被詳 加 分 析 (Jenuwein and Allis, 2001;Strahl and A U i s ，2000)。第 一 次 發 現 與 賴 氨 酸 連 接 的 乙 酰 基 是 在 一 項 對 組 蛋 白 修 飾 的研 究 中 (Jenuwein andAIlis，2001)。組 蛋 白 乙 酰 化 水 平 增 高 通 常 與 基 因 轉 錄 的 局 部 激 活有 關 (Zhang et al. ，2002)。而 組 蛋 白 賴 氨 酸 甲 基 化 則 集 中 于 被 抑 制 基 因 的 啟 動 子 區 域(Berger，2007)。研 究 發 現 ，乙 酰 化 是 動 態 可 逆 的 ，而 甲 基 化 更 穩 定 而 且 「長 壽 」（Bernstein and Allis， 2005)。 盡 管 大 量 研 究 都 集 中 在 這 些 組 蛋 白 上 的 P T M ，但 甲 基 化 和 乙 酰化 修 飾 在 許 多 蛋 白 質 上 都 會 發 生（Glozak et a L ，2005; Grewal and Rice，2004; Sadoul
e t a L , 2008; Y a n g and Seto, 2008)。在 真 核 生 物 中 ，N 端 乙 酰 化 是 最 常 見 的 P T M 之一 ，大 約 8 5 % 真 核 蛋 白 都 會 發 生（Polevoda and S h e r m a n , 2000)。第 一 個 發 現 的 被 乙 酰化 和 去 乙 酰 化 調 節 的 非 組 蛋 白 是 p5 3 蛋 白（G u and Roeder, 1997)。