免疫印跡法
免疫沉淀法
點印跡法
| 實驗方法原理 | 當重組病毒通過噬斑純化和擴增后，免疫印跡可用于鑒定重組蛋白，并檢測其是否有預期的大小以及是否從感染細胞中分泌。下面的步驟是介紹檢測非分泌性（細胞內）蛋白的，如果重組蛋白是分泌到培養基中的，可按注解中的步驟操作。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 生長至匯片的單層 BS-C-1 細胞 重組痘苗病毒儲液 |
| 試劑、試劑盒 | 完全 MEM-5 培養基 胰酶 細胞裂解液 5 × SDS 樣品緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 6 孔組織培養板 Sorvall 離心機 95℃ 水浴鍋 |
| 實驗步驟 |
1. 用生長至匯片的單層 BS-C-1 細胞建立病毒感染細胞培養液（見基本方案 1 步驟 1~5）。 2. 用完全 MEM-5 培養基將 5×105 細胞/孔放入 6 孔組織培養板培養（每孔終體積為 2 ml）。直至細胞匯片生長（應小于 24 h）。 3. 在使用前，將一定體積的痘苗病毒儲液與 0.25 mg/ml 胰酶混合，渦旋混勻。在 37℃ 水浴鍋中保溫 30 min，并在保溫過程中每隔 5~10 min 渦旋混勻一次。 病毒儲液的滴度常常在 2×109 pfu/ml 左右，但根據其來源的不同病毒滴度也可能低一些。 如果經過渦旋混勻后，還可以看見團狀物，將其冷卻到 0℃ 并在冰上超聲波作用 30 s。可以重復幾次超聲，但超聲的間隔中應當使樣品在冰上冷卻。 4. 吸出培養基，加入 1 ml （終體積）MOI 為 10~30 pfu/細胞的完全 MEM-5，培養 1~2 h，每隔大約 30 min 輕輕搖動培養板，使細胞均勻接觸病毒。 如果使用純化的病毒，應在使用前在冰上超聲 30 s （見基本方案 1 步驟 7）。 如果分析的蛋白質分泌到培養基中，要注意在感染和培養細胞的培養基中不應添加血清或使用 1% 的血清，因為高濃度的血清會干擾膠的分析。 5. 加入 2 ml 的完全 MEM-5 培養基，培養 24~48 h。 6. 細胞刮刀輕輕刮下細胞，轉移到離心管中，5~10℃，1800 g 離心 5 min，棄培養基。 對于分泌性蛋白質，用 Centricon 10 microconcentrator （Amicon） 濃縮培養基，使體積縮小到原來的 1/5。此外，培養基中的蛋白質也可以按下面的方法用三氯乙酸（TCA） 沉淀： 6.1 向樣品中加入 Triton X-100 至終濃度為 0.03% （V/V）； 6.2 加入等體積 20% TCA； 6.3 在冰上放置 15 min； 6.4 4℃，以最大轉速離心 15 min； 6.5 吸出上清，用 70% 乙醇洗沉淀； 6.6 空氣晾干沉淀，加入 5 μl 1 mol/L Tris 堿，溶于 1 × SDS 樣品緩沖液。 7. 用 200 μl 細胞裂解液重懸細胞沉淀，將其轉移至微量離心管中。渦旋混勻，在冰上放置 10 min。 8. 4℃，最大轉速離心 10 min。分離上清（細胞質）和沉淀（細胞核）。 9. 在 20 μl 的上清中加入 5 μl 5 × SDS 上樣緩沖液，95℃ 加熱 5 min。將沉淀溶于 200 μl 的 1× SDS 樣品緩沖液，95℃ 加熱 5 min。 10. 按免疫印跡方法進行操作。
展開 |
| 注意事項 |
1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養箱中培養，除非有特殊說明。 2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。 3.細胞裂解液只含有非離子型去污劑，可能不能有效地抽提某些蛋白質。在這種情況下，需要含有 SDS 的緩沖液。 |
