鈣調蛋白的胰蛋白酶消化實驗

消化緩沖液 經 TPCK 處理的胰蛋白酶 HCl 純的鈣調蛋白

材料

經 TPCK 處理的胰蛋白酶（其干粉可從 WorthingtonBiochemicalCorp. 買到)

HCl(1 mmol/L)

純的鈣調蛋白（干粉；無鹽（0.1~1 mg)

試劑

消化緩沖液

(配方，見"試劑的配制'，PP.82~83)

操作程序

1) 稱重 0.1~1mg 胰蛋白酶于 1.5-ml 離心管，并溶于 1mmol/LHCl 中，終濃度為 1 mg/ml。置冰上。

2) 用消化緩沖液溶解鈣調蛋白，終濃度為 1 mg/ml 置冰上。

3) 加一等分胰蛋白酶于鈣調蛋白。該等分含胰蛋白酶的重量應為鈣調蛋白總量的 1/100。例如，對 0.5 mg 鈣調蛋白，加 5ug 胰蛋白酶（5ullmg/ml 胰蛋白酶儲液)。

4) 蓋緊離心管，反應混合物于 37°C 孵育 2 h。

5) 在消化反應正在進行的同時，置剩余的胰蛋白酶儲液于冰上。2 h 后，加另一等分胰蛋白酶（重量還是鈣調蛋白的 1/100) 于消化混合物。蓋緊離心管，再繼續在 37°C 下孵育 4~8 h(或過夜，如可能）。

6) 反應結束時，可將祥品凍干至所需要的程度，或真空離心縮小體積，或直接進樣作 HPLC 分離。樣品可用 HC1 或三氟乙酸酸化至 pH2~3 以終止反應。不過，采取此操作時，要擔點風險，此時，有些等電點低的肽段可能會產生沉淀。