基本方案 小規模表達
輔助方案1 蛋白質生產高峰期的確定
輔助方案2重組蛋白的代謝標記
基本方案2 重組蛋白大規模生產
| 實驗方法原理 |
分析方案依賴于表達蛋白的天然特性。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 草地夜蛾（Sf9）細胞 高滴度的重組桿狀病毒儲液 |
| 試劑、試劑盒 | PBS 1×SDS樣品緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 含 10% 胎牛血清（FBS）的TNM-FH昆蟲培養基 60 mm 組織培養皿 27℃ 培養箱（濕度可選） 15 ml 聚丙烯離心管 帶有 GH-3.7 水平轉子的 4℃ Beckman GPR 離心機 沸水浴／100℃加熱板 超聲儀 |
| 實驗步驟 |
1. 如果目的蛋白為分泌性蛋白 1.1 用 3 ml TNM-FH/10%FBS 培養基將 2.5 × 106 Sf9 細胞接種到 60 mm 組織培養皿中。27℃ 培養 1 h，使細胞牢固貼壁。每份需要檢測的病毒儲液制備一個培養皿，另一個培養皿作為無感染對照。 1.2 用新鮮的 3 ml TNM-FH/10% FBS 培養基更換培養基，接種 0.1 ml 高滴度的病毒儲液到培養皿中，MOI 為 1～10。27℃ 培養 3 天。 1.3 收獲培養皿中的細胞，并將細胞和培養基轉移至 15 ml 聚苯乙烯離心管中。 1.4 4℃，1000 g 離心 10 min (用 GH-3. 7 轉子 2000 r/min)。 1.5 將病毒上清轉移到新管中。 1.6 用 Bradford 方法測定上清中的蛋白質含量，按步驟 7 進行分析。上清液可在 - 80 ℃ 保存數月。 1.7 按照下面的方法對樣品中的蛋白質進行分析。 1.7.1 免疫印跡：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳每泳道中加入 20～40 μg 細胞總蛋白。注意要同時加入無病毒感染的細胞蛋白作為陰性對照。 1.7.2 . 考馬斯亮藍染色：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳每泳道中加入 20～40 μg 細胞總蛋白。如果重組病毒不純，重組蛋白只有當其在感染細胞中有很高表達量時，才能被檢測到。 1.7.3 功能分析：可以用任何一種典型的檢測目的蛋白的方法，如 DNA 結合蛋白遷移率變動分析（針對 DNA 結合蛋白）、體外激酶分析（針對蛋白激酶）、 核苷結合分析（針對可以與核苷結合的蛋白質）或胸苷摻入分析（針對作為生長因子的蛋白質）。 1.7.4 重組蛋白的代謝標記。 如果沒有簡單的分析方法檢測桿狀病毒表達的重組蛋白，應檢測假定的重組子中是否有外源基因 的存在。可以應用 Summers 和 Smith (1987) 提供的簡便的點雜交方法；還可用 PCR 擴增。有一些公司（如 Invitrogen 和 Clontech）提供用于大多數桿狀病毒載體的 PCR 引物。 1.8 通過上述實驗，可以確定假定的重組病毒儲液是否是可以生產目的蛋白的正確重組子。如果確定是正確的重組子，用噬斑試驗純化重組子，使之與污染的野生型病毒分離（如果不是使用線形桿狀病毒 DNA 生產的）。制備大量病毒儲液并測定重組病毒滴度。 2. 如果目的蛋白為非分泌性蛋白 2.1 用 3 ml TNM-FH/10%FBS 培養基將 2.5 × 106 Sf9 細胞接種到 60 mm 組織培養皿中。27℃ 培養 1 h，使細胞牢固貼壁。每份需要檢測的病毒儲液制備一個培養皿，另一個培養皿作為無感染對照。 2.2 用新鮮的 3 ml TNM-FH/10% FBS 培養基更換培養基，接種 0.1 ml 高滴度的病毒儲液到培養皿中，MOI 為 1～10。27℃ 培養 3 天。 2.3 收獲培養皿中的細胞，并將細胞和培養基轉移至 15 ml 聚苯乙烯離心管中。 2.4 4℃，1000 g 離心 10 min (用 GH-3. 7 轉子 2000 r/min)。 2.5 棄上清。洗滌細胞，將細胞沉淀在 PBS 中重懸，按照步驟 4 離心，棄上清。 2.6 在每份沉淀中加入 500 μl 的 1 × SDS 樣品緩沖液，置于沸水浴或 100℃ 加熱板上加熱 5～10 min。因為有 DNA 的存在，液體可能會黏稠，則需要超聲樣品，直到樣品變清，用 Bradford 方法測定蛋白質含量。按步驟 7 進行分析。 此外，還可用 0.5 ml 適當的含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液（裂解緩沖液根據細胞類型的不同而 不同，昆蟲細胞裂解液見附錄 1)。6 × His 融合產物不能用含 EDTA 的裂解緩沖液。4℃ 離心 10 min 以澄清裂解液，將上清轉移到新管中。100 μl 的裂解物中加入 100 μl 的 2 × SDS 樣品緩沖液，沸水浴中加熱 3 min。剩余裂解液可在 - 80℃ 保存數月。 2.7 按照下面的方法對樣品中的蛋白質進行分析。 2.7.1 免疫印跡：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳每泳道中加入 20～40 μg 細胞總蛋白。注意要同時加入無病毒感染的細胞蛋白作為陰性對照。 2.7.2 . 考馬斯亮藍染色：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳每泳道中加入 20～40 μg 細胞總蛋白。如果重組病毒不純，重組蛋白只有當其在感染細胞中有很高表達量時，才能被檢測到。 2.7.3 功能分析：可以用任何一種典型的檢測目的蛋白的方法，如 DNA 結合蛋白遷移率變動分析（針對 DNA 結合蛋白）、體外激酶分析（針對蛋白激酶）、 核苷結合分析（針對可以與核苷結合的蛋白質）或胸苷摻入分析（針對作為生長因子的蛋白質）。 2.7.4 重組蛋白的代謝標記。 如果沒有簡單的分析方法檢測桿狀病毒表達的重組蛋白，應檢測假定的重組子中是否有外源基因 的存在。可以應用 Summers 和 Smith (1987) 提供的簡便的點雜交方法；還可用 PCR 擴增。有一些公司（如 Invitrogen 和 Clontech）提供用于大多數桿狀病毒載體的 PCR 引物。 2.8 通過上述實驗，可以確定假定的重組病毒儲液是否是可以生產目的蛋白的正確重組子。如果確定是正確的重組子，用噬斑試驗純化重組子，使之與污染的野生型病毒分離（如果不是使用線形桿狀病毒 DNA 生產的）。制備大量病毒儲液并測定重組病毒滴度。
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