硫酸銨沉淀法
| 實驗方法原理 |
當高濃度鹽存在時，蛋白質往往凝聚并析出沉淀。這一技術稱為「鹽析」。不同的蛋白質在不同濃度的鹽中形成沉淀，所以鹽析常用于蛋白質的分離純化。幾種因素如 pH 、溫度、蛋白質純度在測定各種蛋白質的鹽析時起著重要作用。 選擇硫酸銨是因為它具有一些優良性質，如鹽析的有效性、pH 范圍廣、溶解度高、溶液散熱少和經濟適用。 硫酸銨濃度常以百分濃度表示，以 X％ 表示所需配制的溶液濃度，表示開始的溶液濃度，所需的硫酸銨克數按以下公式計箅： g＝515（X－X0）/（100－0.27X） 大多數蛋白質在 55％ 硫酸銨中沉淀，獲得最大量蛋白質沉淀是 85％ 硫酸銨溶液，以不含硫酸銨的 100 ml 蛋白質溶液為起始溶液。 |
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| 實驗材料 | 蛋白質溶液 |
| 試劑、試劑盒 | 硫酸銨 用于懸浮沉淀物的緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 燒杯 磁力攪拌器和攪拌子 離心機和轉頭 |
| 實驗步驟 |
1. 將盛有蛋白質溶液的燒杯放在裝另一裝有冰水的大燒杯內，并置于磁力攪拌器上攪拌； 2. 邊攪拌，邊徐徐加入 56.8 g 硫酸銨至飽和，該步驟應在 5～10 min 內完成； 3. 繼續攪拌 10～30 min； 4. 10 000×g 離心 10 min 或 3000×g 30 min； 5. 棄去上清液。將沉淀懸浮于 1～2 倍沉淀物體積的緩沖液中，殘留的不溶性物質可能是變性蛋白，通過離心除去； 6. 硫酸銨能夠通過透析，超濾或脫鹽柱除去。
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| 注意事項 |
1. 攪拌必須是有規則的和溫和的。攪拌太快將引起蛋白質變性，其變性特征是起泡。用磁力攪拌器不明顯產熱，這一點也很重要。 2. 大多數蛋白質在鹽溶解后的前 20 min 沉淀，一些蛋白質要經數小時才能完全沉淀。 3. 為了平衡硫酸銨溶解時產生的輕微酸化作用，沉淀反應至少應在 50 mmol/L 緩沖液中進行。 4. 緩沖液應含有鰲合劑如 EDTA 以除去硫酸銨中微量的重金屬離子，因為這些離子對目的蛋白質是有害的。 5. 為確保獲得最大量沉淀，使用蛋白質初始濃度至少為 1mg/ml。 6. 硫酸銨沉淀反應通常是貯存和穩定蛋白質的良好方法。 7. 少數蛋白質在硫酸銨濃度低于 24％ 時就產生沉淀，而大多數要在 80％ 以上才能沉淀。在純化的初始階段，常利用蛋白質在硫酸銨中溶解度的差異分離蛋白質。硫酸銨沉淀可除去 RNA 和 DNA。 8. 在蛋白質的等電點其溶解度降低，在此條件下，靜電的相互作用可導致蛋白質凝聚和沉淀在蛋白質的等電點，低濃度的硫酸銨就能沉淀蛋白質。 9. 在蛋白質結晶實驗中，采用硫酸銨沉淀十分有效。
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