新生大鼠心肌細胞原代培養實驗

SD 乳鼠

低糖 DMEM、胰酶 EDTA 青鏈霉素 碳酸氫鈉液 新生牛血清 谷氨酰胺 D-Hank's 液 新潔爾滅 碘酒 酒精

鋁盒 眼科直剪 眼科彎剪 眼科直鑷 眼科彎剪 玻璃培養皿 廣口瓶 棉球 燒杯 錐形瓶 離心管 磁力攪拌器 攪拌子 水浴振蕩器 尼龍篩網 針式濾器

一、實驗材料準備 
 

1.  動物
 

出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。

2.   試劑
 

低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青鏈霉素、碳酸氫鈉液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酒精，培養液(DMEM，新生牛血清，青鏈霉素)。

3.   手術器械和儀器
 

鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心臟組織)、100 ml 廣口瓶兩個(分別裝碘酒和酒精棉球)、500 ml 燒杯、250 ml 錐形瓶、15 ml和 50 ml 的離心管，磁力攪拌器和攪拌子(或者水浴振蕩器)、150-200 目尼龍篩網和針式濾器。

二、方法
 

1.   將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度，并放置于 37℃水浴中溫育好。

2.  解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復以上過程。取材完畢后，撤掉取材的手術器械。

注：為了保證心肌細胞的活力，取心的操作過程盡量快，另外，最好把盛的心臟的培養皿放置在冰臺上或者預冷的平衡鹽液中。

3.   用第二套手術器械進行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個預先裝好D-Hank's液的培養皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養皿中(或者其它合適容器中，視個人習慣)，加少許 0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm³大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉入錐形瓶中，補加胰酶至終體積10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中(可以用一個消毒的500 ml燒杯，裝好無菌的蒸餾水，加夠水量，水位線稍低于250 ml錐形瓶的刻度線即可，過少則溫度會不均勻，過高容易污染。打開磁力攪拌器電源，預先將水溫調節到 37℃)，調節轉速至 60 rpm左右，消化15 min(務必保證水浴溫度恒定在 37℃，并且消化時間不超過 15 min)。或者，如果采用的是水浴震蕩器的話，不用加攪拌子，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉速和消化時間相同。

4.  從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細胞和成纖維類細胞。

5.    加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機械分散細胞(組織消化后會成為粘稠的膠體狀)，注意：不要過分吹打，否則會導致組織過度消化，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數目少(比如 5、6 只的時候)，消化時間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過度。上述消化處理的同時，往一支 50 ml 的一次性無菌離心管中加入 20 ml 預冷的含 10%血清的培養液，并放置冰臺上。消化處理之后，小心移出上清轉至上述加有培養液的離心管中，第一次消化收集的分離出的細胞，第一次消化結束后；繼續第二次消化，余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續消化。

6.  重復 5 消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數的組織塊(不含棄去消化液的那次)。

7.  第 1、2 次含細胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網后，一起離心；第 3、4 次含細胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網后，一起離心。最后，分別用 8 ml含 20%血清的培養液重懸兩管細胞，接種到一個 75 cm²的塑料培養瓶中，放置在培養箱中 1.5 小時后，取出，棄貼壁細胞(主要是成纖維細胞和內皮細胞)，將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數后，加入培養液調整細胞濃度為5-6x10⁵個/ml，接種到目的培養器皿中。

5.    一般不用加BrdU，如果培養時間長(發現成纖維細胞也極少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細胞增殖。加了BrdU，心肌細胞搏動的持續時間會更長。

9.    接種后 24 小時，用溫的培養基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養的心肌細胞一次，以去處未貼壁的細胞(部分細胞會在 24 小時后貼，結果很多細胞重疊生長)，再更換培養液，即可。可以按照實驗需要在培養 48 h 或 72 h 后施加處理因素。

三、 結果
 

心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在 24 h左右基本貼壁，此時細胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細胞胞體則呈現不規則形狀，如多角形，部分細胞有聚集傾向，細胞搏動效果較好， DMEM培養基在初始培養時為深紅色，兩天后變為淡黃色，應該是營養成分下降的表現，也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養方法加以補充。鑒定的最簡單的辦法就是搏動與否，注意：當搏動比較微弱的時候，在 10 倍物鏡下可能看不到搏動，換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的最好的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力。另外，心肌細胞表達肌動蛋白，可以作為鑒定，但不是唯一的特征性指標，因為平滑肌細胞也表達。

乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞，培養過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度胰酶消化方法，0.06%濃度的胰酶對細胞損害較小，但這個濃度消化所需時間較長。采取多次反復低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁 1.5 h，充分去除成纖維類細胞，達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀，并且會增殖，不搏動，很好和心肌細胞鑒別。消化和吹打一定不要過度，是保證心肌細胞活力最重要的一個原則。而接種密度(一般不低于 10⁵/ml)，也將影響到心肌細胞的搏動及同步化搏動。

一、實驗討論

乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞，培養過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度胰酶消化方法，0.06%濃度的胰酶對細胞損害較小，但這個濃度消化所需時間較長。采取多次反復低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁 1.5 h，充分去除成纖維類細胞，達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀，并且會增殖，不搏動，很好和心肌細胞鑒別。消化和吹打一定不要過度，是保證心肌細胞活力最重要的一個原則。而接種密度(一般不低于 10⁵/ml)，也將影響到心肌細胞的搏動及同步化搏動。

心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在 24 h左右基本貼壁，此時細胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細胞胞體則呈現不規則形狀，如多角形，部分細胞有聚集傾向，細胞搏動效果較好， DMEM培養基在初始培養時為深紅色，兩天后變為淡黃色，應該是營養成分下降的表現，也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養方法加以補充。鑒定的最簡單的辦法就是搏動與否，注意：當搏動比較微弱的時候，在 10 倍物鏡下可能看不到搏動，換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的最好的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力。另外，心肌細胞表達肌動蛋白，可以作為鑒定，但不是唯一的特征性指標，因為平滑肌細胞也表達。