平板細胞克隆形成試驗

細胞樣品

胰蛋白酶 胎牛血清 DMEM培養液 PBS 多聚甲醛 GIMSA染液

培養皿 培養箱 顯微鏡

1、取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養液中備用。

2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃ 5%CO₂及飽和濕度的細胞培養箱中培養2——3周。

3、經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10——30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。

1. 試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

2. 細胞在進行克隆形成實驗時要求有95%以上的分散度，否則結果的準確度會受到很大影響。

1. 克隆形成率公式：克隆形成率 =（克隆數/接種細胞數）×100% ，細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量。

2. 一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。