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RNA 的制備
制備探針的所有溶液以及雜交后的洗脫液都必須無 RNA 酶。溶液需經
DEPC 處理，于 121°C 高壓滅菌 20 min。雖然這一過程可以清除絕大部分 RNA 酶，但由于天然 RNA
酶存在廣泛，即使小心操作，也不能保證玻璃器皿和吸頭上殘留的 RNA 酶被徹底清除。因此進行 RNA 操作時，需要單獨使用一套吸頭，用前以
DEPC 水常規過夜浸泡，或用相應的 RNA 酶抑制劑處理，如 RNase-Zap (
Ambion)；所有的玻璃器皿要用鋁箔包裹好，使用前要經高壓滅菌處理；Eppendorf 離心管應用 DEPC 水或 RNase-Zap
處理，然后高壓滅菌。
探針制備
RNA探針（核糖體探針〉
制備 RNA 探針需要一條與靶序列對應的 DNA 鏈為模板，通過放射性核苷酸摻入，生成正義及反義 RNA 探針。
如果需要制備高活性探針，理想的選擇是單鏈
RNA 探針；通常探針長度為 200~1000 個堿基對（bp )，但最適長度為 150~200
bp，因為標記的探針越長，其組織穿透力越弱。如果需要，可用有限堿性水解反應來縮短探針長度。RNA-RNA 或 RNA-DNA
雜交鏈比寡核苷酸-寡核苷酸及 DNA-DNA 雜交鏈更為穩定，因此使用前兩者作為探針最常見。
商品化探針及對照探針
商品化的肌動蛋白（actin
) 和三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH ) 的 DNA 模板可以用來制備 RNA
探針，由于這兩種基因同屬管家基因，且在真核細胞中普遍表達，故常用作陽性對照。陰性對照常采用正義鏈探針，使用陰性對照可以排除假陽性，所得結果更為準確。在每次雜交的載玻片上，還應該加載一個組織類型明確、具有特定
RNA 表達譜的腫瘤標本，作為陽性樣本對照，用以客觀評價雜交結果。這些陽性對照標本已商品化，可從相關的生物公司購得。
質粒 DNA 的線性化
1. 向每個微量離心管中加入 10~20 μg DNA。
2. 每微克 DNA 中加 10 單位限制性內切酶，按產品說明書進行酶切消化。
3. 37°C 條件下消化 3 h 或過夜消化。
酚/氯仿抽提
4. 加入 400 μl 酚-氯仿-異戊醇（pH 8.0 )，旋渦振蕩混勻。
5. 室溫下 13 000 rpm 離心 3 min。
6. 收集上清，將其移入新管中，加入 10 μl 的 NaAc (3 mol/L，pH 8 ) 。
7. 加入 250 μl 100% 乙醇（保藏于 -20°C )。
8. 加入 1 μl 糖原，用于促進 DNA 沉淀。
9. 將離心管置于干冰上 1 h 。
10. 13 000 rpm 離心 15 min。
11. 棄去上清，保留沉淀。
12. 加入 400 μl 70% 乙醇（保藏于 -20°C）洗滌沉淀。
13. 13 000 rpm 離心 10 min。
14. 棄去 70% 的乙醇，將沉淀在室溫下晾干。
15. 依據 DNA 的使用量，用 10~20 μl DEPC 水再次溶解（見步驟 1 )，制成終濃度 1 μg DNA /μl 為宜。
16. 取 0.5 μl DNA 樣本液，用 1% 瓊脂糖凝膠進行電泳。
RNA標記
涉及放射性核苷酸摻入的操作方法，請參考 Amersham 試劑盒（RPN3100；Amersham Biosciences ) 附帶說明，步驟如下：
1. 在一個微量離心管中混合以下成分
(a)4 μl 5× 轉錄緩沖液，
(b)1 μl 0.2 mol/L DTT，
(c)1 μl HPRI，
(d)0.5 μl ATP、CTP 及 GTP，
(e)1 μl 線性 DNA 模板（1 μg/ml )，
(f)9.5 μl 35S-UTP，
(g)2 μl RNA 聚合酶。
2. 混勻各成分，并將溶液置于 37℃，1.5 h
DNA 酶法提取 DNA 模板
3. 加入 10 U DNase I 。
4. 加入 RNase 抑制劑 1 μl。
5. 將溶液混勻，37°C 放置 10 min。
去除未摻入的核苷酸
6. 用 2 ml 柱緩沖液平衡 G50 葡聚糖層析柱。
7. 將探針上柱。
8. 加入 400 μl 的層析柱緩沖液洗脫，靜置使洗脫液全部流出，棄掉。
9. 再加入 400 μl 的層析柱緩沖液，用 Eppendorf 離心管收集洗脫液。
酚/ 氯仿抽提
10. 向 Eppendorf 離心管的收集液中加入 400 μl 酚（pH 5.0 ) ，旋渦振蕩混勻，13 000 rpm 離心 3 min。
11. 收集上清液，移至一個新的微量離心管中，向其加入 400 μl 氯仿-異戊醇，旋渦振蕩混勻 13 000 rpm 離心 3 min。
12. 收集上清液，取 1 μl 的上清液測定摻入量。
13. 剩余的上清液加入 2.5 倍體積的 -20℃ 冰凍 100% 乙醇。
14. 加入 1 μl 的酵母糖原，以促進沉淀。
15. 將 Eppendorf 管置于空氣中晾干，30 min。
16. 13 000 rpm 離心 15 min。
17. 吸去殘留的乙醇，切勿觸及沉淀。
18. 用 70% 乙醇洗滌沉淀物，再以 13 000 rpm 離心 10 min，然后棄去乙醇。
19. 晾干沉淀，而后用 50 mmol/L DTT 再次懸浮（制成懸液），用以下方法計算應加 50 mmol/L DTT 的體積：
(a)取步驟 12 得到的上清液 1 μl，加 2~3 ml 閃爍液，并在液閃計數儀上測定每分鐘閃爍次數（CPM )
(b) DTT 體積= CPM × 400 ÷ （6×105）
公式中的 400 是在加入酚/氯仿抽提液后的體積，6×105 是在 DTT 溶液中測得的總 CPM 值。
(c)據此得出 50 mmol/L DTT 所應加的體積。
20. 取出 1 μl 溶液，然后再次計數 CPM，以確認探針的比活性。
原位雜交
標本的制備
下述操作步驟的目的在于保持組織結構和形態的完整，不破壞細胞
RNA。用快速冷凍或福爾馬林固定等方法處理組織樣本，可以避免 RNA 降解。而使用 4 % 的多聚甲醛及 4 %
的甲醛等交聯固定液固定，既可保全 RNA，又不影響 RNA
的特異性結合，不失為首選。組織的固定時間取決于樣品的大小。固定的時間越長，組織的形態保持就越好，但是這也會降低與探針的結合力。石蠟可作為包埋劑，經過石蠟包埋的標本可切成厚度為
1 μm 的薄片，且很容易在雜交前脫蠟。由于石蠟切片還需多種溶液的后續處理，建議使用包被玻片，以保證樣品不被滑落。冰凍樣品應冷卻到 -70°C
再進行切片，冰凍切片需放置在包被玻片上進行固定。
雜交前的組織制備
雜交前，進行如下處理的目的在于，增加 RNA
靶序列與探針的親和力、降低非特異背景。經蛋白酶處理的樣品，其靶核苷酸與探針的親和力會相應提高，特別是當探針長度大于 100 bp
時。為了抑制組織蛻變，必須用甲醛對樣品進行后固定處理，這一點十分重要。應用冰乙酸進行乙酰基化處理，可降低由于結合蛋白氨基端而產生非特異性背景。在組織制備過程中，要高度重視
RNA 酶的降解作用。為了去除任何可能的污染，所有玻璃制品和溶液必須分別進行無菌消毒和 DEPC 處理。
整個操作中都必須戴手套。要盡量減少觸摸組織切片的機會。
雜交
對于某些探針/靶序列能否穩定結合，雜交溫度非常關鍵。福爾馬林雖說是一種螺旋鏈的去穩定劑，但雜交緩沖液中如果加入福爾馬林，會降低雜交鏈的解鏈溫度，使雜交過程有可能在一個溫度較低的環境中進行。雜交溫度越低，對于維持組織的結構越有利。至今，研究發現最適溫度為
52°C 。在雜交緩沖液中加入硫酸右旋糖酐可相應減少雜交體積、增加探針濃度、縮短雜交時間。盡管雜交反應在 5~6 h
內可基木完成，但是通常都采用過夜雜交。在雜交緩沖液加入適當的鈉離子會起到穩定雜交體系的作用。
雜交后的洗脫
雜交后洗脫的主要目的在于通過選擇不同的溫度、鹽濃度、甲酰胺濃度來去除未結合的或非特異性結合的探針。可采用 RNA 酶來消化單鏈 RNA 及未結合的靶序列，但是它不會降解已經結合的 RNA-RNA 復合物。
石蠟切片的預處理
1. 用組織洗滌液（Histoclear ) 對石蠟切片進行 2 次脫蠟，共 10 min。
2. 用梯度濃度（100%、90% 、70% 、50% 、30% ) 乙醇進行再水合，每次 10 s。
3. 用 0. 85% NaCl 及 D-PBSA 溶液分別淋洗 5 min。
4. 將組織切片置于 200 ml 蛋白酶 K 緩沖液中（由 400 μl 蛋白酶 K 儲存液稀釋而成），消化 7.5 min。
5. 用 D-PBSA 淋洗 3 min。
6. 用 4% 甲醛或 4% 多聚甲醛進行后固定。
7. 用 DEPO 水淋洗 1 min。
8. 在通風櫥中，用 0.1 mol/L 的 200 ml 三乙醇胺（含 500 μl 冰乙酸）溶液對切片進行乙酰化處理 10 min，期間不斷充分攪拌。
9. 以 D-PBSA 及 0.85% NaCl 分別淋洗 5 min。
10. 在梯度濃度（30% 、50% 、70% 、90% 、100% ) 乙醇中進行脫水，各 10 s。
11. 將切片晾干。
探針的制備及雜交
12. 分別取 1 mol/L DTT 16 μl，60% 雜交液（Hybridmix ) 344 μl 及探針 40 μl，混合，旋渦振蕩混勻，離心片刻，該混合液可供 20 張石蠟切片雜交。
13. 將探針于 80°C 變性 3 min，之后于冰上冷卻。
14. 各取 20 μl 步驟 12 的探針混合液，分別滴入到 20 張組織切片上，用玻璃蓋玻片蓋片。
15. 于溫度為 52°C 的飽和濕度孵箱內過夜雜交。
雜交后的洗脫
16. 將洗脫液預熱到所需溫度。
17. 50°C 條件下，用 200 ml 洗脫液（含 250 μl β-巰基乙醇的 5×SSC ) 淋洗切片 30 min。
18. 65°C 條件下，用 200 ml 洗脫液（含 50% 甲酰胺和 1.4 ml β-巰基乙醇的 2×SSC ) 淋洗 20 min。
19. 37°C 條件下，用 200 ml RNase 緩沖液淋洗 2 次，每次 10 min。
20. 37°C 條件下，用 200 ml RNaseA 緩沖液（含 400 μl RNaseA ) 淋洗 30 min。
21. 重復步驟 19，改為每次淋洗 15 min。
22. 重復步驟 18。
23. 50°C 條件下，依次用 200 ml 5×SSC 及 200 ml 0.1×SSC 淋洗，各 15 min。
24. 在一組不同濃度（50% 、70% 、100% ) 的乙醇中脫水，各 1 min。
25. 晾干切片。
26. 在明膠溶液中浸泡載玻片 1 min，然后風干。
放射自顯影
詳見方案 27. 3 。
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