學術干貨│熒光光譜入門(一)：熒光光譜基礎

　　1.什么是熒光？

　　物體經過較短波長的光照，把能量儲存起來，然后緩慢發出較長波長的光，發出的這種光就叫熒光。物質在吸收入射光的過程中，光子能量傳遞給物質分子。分子被激發，電子從較低能級躍遷到較高能級，形成電子激發態分子。電子的激發態的多重態用2s+1表示，s為自旋角動量量子數的代數和，數值為0或1。分子中同一軌道里所占據的兩個電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對。分子中全部電子都自旋配對，即s=0，該分子處于單重態，用S表示。若分子吸收能量后電子躍遷過程中不發生自旋方向的變化，這時分子處于激發的單重態；若躍遷伴隨自旋方向改變，這時分子具有兩個自旋不配對的電子，即s=1，分子處于激發的三重態，符號T表示。符號S0、S1和S2分別表示分子的基態、第一和第二電子激發單重態，T1和T2則分別表示第一和第二電子激發三重態。

圖1 分子的激發與失活過程

　　激發態的分子不穩定，可以通過輻射躍遷（熒光、磷光）和非輻射躍遷（振動弛豫、內轉換、外轉換、系間竄越）的失活過程返回基態。熒光是分子從第一激發單重態的最低振動能級躍遷到基態各振動能級時所產生的光子輻射，熒光輻射能比激發能量低，熒光波長大于激發波長。熒光發射時間為10-9~10-7s，多為S1→S0躍遷。磷光是分子從第一激發三重態的最低振動能級躍遷到基態各振動能級時所產生的光子輻射，磷光輻射能比熒光輻射能量低，磷光波長大于熒光波長。磷光發射時間為10-4~10s，多為T1→S0躍遷。

　　2.什么是熒光光譜？

　　任何熒光化合物都具有兩個特征光譜：激發光譜和發射光譜。激發光譜反映了某一固定的發射波長下所測量的熒光強度對激發波長的依賴關系；發射光譜反映了某一固定激發波長下所測量的熒光的波長分布。

圖2 室溫下菲的乙醇溶液的激發光譜和熒(磷)光光譜

　　熒光光譜能夠提供激發譜、發射譜、峰位、峰強度、量子產率、熒光壽命、熒光偏振度等信息，熒光分析定性和定量的基礎。

　　熒光光譜的特點：（1）Stokes位移。激發光譜與發射光譜之間有波長差，發射光譜波長比激發光譜波長長；（2）發射光譜的形狀與激發波長無關；（3）鏡像規則，熒光發射光譜與它的吸收光譜成鏡像對稱關系。

　　3.什么是熒光壽命？

　　熒光物質具有兩個重要的發光參數：熒光壽命和熒光量子產率。熒光壽命（τ）是指當激發停止后，分子的熒光強度降到激發時最大強度的1/e所需的時間，它表示粒子在激發態存在的平均時間，通常稱為激發態的熒光壽命。與穩態熒光提供一個平均信號不同，熒光壽命提供的是激發態分子的信息，前者可以告訴你事情發生了，而后者可以告訴你為什么發生。

圖3 熒光壽命示意圖

　　熒光壽命與物質所處微環境的極性、黏度等有關，可以通過熒光壽命分析直接了解所研究體系發生的變化。熒光現象多發生在納秒級，這正好是分子運動所發生的的時間尺度，因此利用熒光技術可以“看”到許多復雜的分子間作用過程，例如超分子體系中分子間的簇集、固液界面上吸附態高分子的構象重排、蛋白質高級結構的變化等。熒光壽命分析在光伏、法醫分析、生物分子、納米結構、量子點、光敏作用、鑭系元素、光動力治療等領域均有應用。

　　熒光壽命的測定技術有時間分辨單光計數技術(TCSPC)、相調法、閃頻法。其中TCSPC具有靈敏度高、測定結果準確、系統誤差小的優點，是目前最流行的的熒光壽命測定方法。

　　4.什么是熒光量子產率？

　　熒光量子產率（φf）是熒光物質另一個基本參數，它表示物質發生熒光的能力，數值在0~1之間。熒光量子效率是熒光輻射與其他輻射和非輻射躍遷競爭的結果。

　　式中， kf為熒光發射過程的速率常數， ∑ki為其他有關過程的速率常數總和。一般來說， kf主要決定于化學結構，而 ∑ki主要決定于化學環境，同時也與化學結構有關。

　　5.分子結構與熒光？

　　并不是所有的分子都能產生熒光，分子產生熒光必須具有：合適的結構和一定的熒光量子產率。熒光產生與分子結構的關系如下：

　　（1）電子躍遷類型。大多數熒光化合物都是由π→π*或n→π*躍遷激發，然后經過振動弛豫或其他非輻射躍遷，在發生π*→π或π*→n躍遷而產生熒光，其中π*→π熒光效率最高。

　　（2）共軛效應。含有π*→π躍遷能級的芳香族化合物的熒光最常見且最強。具有較大共軛體系或脂環羰基結構的脂肪族化合物也可能產生熒光。

　　（3）取代基效應。苯環上有吸電子基常常會妨礙熒光的產生，而給電子基會使熒光增強。

　　（4）平面剛性結構。具有平面剛性結構的有機分子大多具有強烈熒光，因為該結構可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用。

　　6.什么是熒光分析？

　　熒光分析就是基于物質的光致發光現象而產生的熒光的特性及其強度進行物質的定性和定量的分析方法。目前，也廣泛地作為一種表征技術來研究體系的物理、化學性質及其變化情況，例如生物大分子構象及性質的研究。

　　熒光光譜適用于固體粉末、晶體、薄膜、液體等樣品的分析。根據樣品分別選配石英池（液體樣品）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）。

　　熒光光譜分析可與顯微鏡耦合，獲得微區分析結果。熒光是無損傷、非接觸的分析技術，還可用于自動檢驗、批量篩分、遠程原位分析和活體分析。

　　熒光分析的優點：（1）靈敏度高；（2）選擇性強；（3）試樣量少、方法簡單；（4）提供較多的物理參數。但是也存在應用范圍不夠廣泛、對環境敏感（干擾因素多）等缺點。

　　7.熒光光譜定性分析依據？

　　不同結構熒光化合物都有特征的激發光譜和發射光譜，因此可以將熒光物質的激發光譜與發射光譜的形狀、峰位與標準溶液的光譜圖進行比較，從而達到定性分析的目的。

　　8.熒光光譜定量分析原理？

　　在低濃度時，溶液的熒光強度與熒光物質的濃度成正比：F=Kc。其中，F為熒光強度，c為熒光物質濃度，K為比例系數。這就是熒光光譜定量分析的依據。

　　上述關系不適用于熒光物質濃度過高時，熒光物質濃度過高，其熒光強度反而降低。原因有：

　　（1）內濾效應。一是，當溶液濃度過高時，溶液中雜質對入射光的吸收作用增大，相當于降低了激發光的強度。二是，濃度過高時，入射光被液池前部的熒光物質強烈吸收，處于液池中、后部的熒光物質，則因受到入射光大大減弱而使熒光強度大大降低；而儀器的探測窗口通常對準液池中部，從而導致檢測到的熒光強度大大降低。

　　（2）相互作用。較高濃度溶液中，可發生溶質間的相互作用，產生熒光物質的激發態分子與其基態分子的二聚物或其他溶質分子的復合物，從而導致熒光光譜的改變和/或熒光強度下降。當濃度更大時，甚至會形成熒光物質的基態分子聚集體，導致熒光強度更嚴重下降。

　　（3）自淬滅。熒光物質的發射光譜與其吸收光譜呈現重疊，便可能發生所發射的熒光被部分再吸收的現象，導致熒光強度下降。溶液濃度增大時會促使再吸收現象加劇。

　　當然，熒光強度的影響因素還有溶劑、溫度、pH值、散射光等，在定量分析中需要加以考慮。

　　熒光光譜定量分析的計算與其他光譜類似，包括標準曲線法、比例法等。

　　9.什么是熒光淬滅？

　　熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子相互作用引起熒光強度降低的現象就是熒光淬滅。引起熒光淬滅的物質稱為熒光淬滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物等。熒光淬滅的主要形式有：碰撞淬滅（最主要的）、靜態淬滅、轉入三重態淬滅、發生電荷轉移反應的淬滅、自淬滅。

　　基于熒光物質所發出的熒光被分析物淬滅，隨著被分析物濃度增加，溶液的熒光強度降低，建立了熒光淬滅法。可以用來監控溶液中的微量氧、某些無機化合物的測定等。

　　10.熒光光譜的應用領域？

　　熒光光譜已應用于很多不同領域，特別是需要無損、顯微、化學分析、成像分析的場合。無論是需要定性還是定量的數據，熒光分析都能快速、簡便地提供重要信息。

圖4 熒光光譜的應用領域