流式細胞儀檢測實驗用TUNEL流式細胞定量凋亡細胞

要分析的細胞

PBS95%乙醇（不是100%乙醇）冰冷多聚甲醛固定液TdT反應液TdT 生物素-dUTP混合液異硫氰酸熒光素（FITC)-鏈霉親和素（streptavidin)結合物

12 mm×75 mm圓底離心管配有269模型轉子的IEC 6R6000離心機（或相當的設備）

1a)多色分析：進行免疫熒光染色。重懸染色細胞于PBS，轉移含5×10⁵個細胞的細胞液至一 12 mm×75 mm圓底離心管。必須確保用于多色染色的熒光團沒有被TUNEL步驟的固定劑破壞。FITC、PE和Texas紅不受影響。

Duochromes (PE和Texas紅的結合物，如Red 613)也不受影響，但是別藻藍素（APC)會被固定劑破壞。

1b) TUNEL檢測：轉移含5 ×10⁵的細胞液至一 12 mm×75 mm圓底離心管。

2)加入1?2 ml PBS,然后 4℃，300 g (IEC 269轉子則為1200 r/min)離心5 min 沉淀細胞，棄上清。重懸沉淀于250μL PBS，然后邊輕柔渦旋振蕩邊5?10 s—滴一滴地加入750μL冰冷的95%乙醇。4℃孵育20 min。

3)加入2 ml PBS洗滌細胞，4℃，400 g離心5 min。棄上清。

4)傾斜試管用余下的緩沖液重懸細胞，邊輕柔渦旋振蕩，邊間隔5?10 s滴加入1 ml多聚甲醛固定液。室溫孵育30 min。

5)按步驟3同樣用PBS洗滌細胞，如果需要可于4℃暗室儲存幾天。

6)按步驟3同樣洗滌細胞，用0.5 ml TdT反應液替代PBS。棄上清后立刻反轉試管口于吸水紙上，以此盡可能多地棄除上清。

7)加入50μL TdT/生物素-dUTP混合液到細胞沉淀里，于37℃孵育45 min。

8)按步驟3同樣用PBS洗滌細胞，然后加入10μL FITC-鏈霉親和素結合物（以制造商推薦的稀釋液）。室溫孵育30min，然后按步驟3用PBS洗滌細胞。

9)進行流式細胞儀分析