【技術指南】流式細胞儀和流式細胞術

Jay Haron Ph. D.   jay.haron@gmail.com   BD Biosciences, San Diego, United States

引用

實驗材料和方法
  從1968年最早的商品化 流式細胞術(FC) 和熒光激活細胞分類術(FACS)誕生以來, 它們已得到大大改進。但要成為實驗室廣泛接受的技術，除成本因素外，還存在不少障礙。技術上的問題主要是細胞內低豐度分子的檢測，缺少“通用”細胞通透物 質，細胞自發熒光的干擾效應，熒光分子間發射光譜的重疊，以及缺少可識別目標分子的試劑。特別是對于細胞分揀來說，由于液滴的形成收集、分揀細胞重分析或 培養前的稀釋，以及為獲得足夠數量的可用細胞需要的時間延誤的原因，還存在細胞存活問題。最后，特別是在處理低豐度對象時，數據分析也是很棘手的。

有一篇關于 流式細胞儀理論的不錯的綜述，介紹了流式細胞儀的操作語言。此外，還有另一篇文章涵蓋了提供流式細胞儀所用特定試劑的 主要抗體供應商。本文將聚焦于以下幾點：
1）硬件的選擇和注意事項
2）流式細胞儀和細胞分選的實際問題
3）數據分析和軟件。這幾個話題包含的內容不展開論述

希望讀者在著手開展表1列出的一些流式細胞儀應用研究前，了解一些注意事項。 

表1. 流式細胞儀和/或細胞分揀的常見應用

硬件

在決定需要什么實驗設備的時候，細胞生物學家需要了解自己的預計需求和預算。表2列出了市場上可有的選擇。由于這些設備會不斷更新，建議到制造商查詢。

表 2. 主要設備供應商

做小顆粒分析的專業公司（JSAN, Partec, Accuri）將他們的服務定位于個體實驗室或需對其細胞分揀儀做恒定質量分析的實驗室。他們通常會用到改進的更小的激光二極管和微流體。但如果需要做每 日監控或者對大型項目（如臨床試驗）的多臺儀器的數據進行比較，其軟件沒有大公司的強大。一個建議是確保儀器輸出文件能夠同您打算使用的收集后分析軟件兼容。
研究人員對研究對象進行了分類，超大型（浮游生物、母細胞、早期胚胎），非常小（微粒、細菌）或者高度不對稱（精子、肌小管）。確保您將要使用的儀器以前在這一應用中被成功使用過。噴嘴直徑、流動細胞的幾何形狀、流速、液滴大小、檢測器位置都會影響到結果。
再生醫學和癌癥治療研究通常要求對細胞進行分離以確保純度、細胞活力，并且便于在流式細胞儀實驗室和病人間運送。Closed cartridges (Owl，Cytonome公司) 似乎是制造商為解決這一問題的一個嘗試。另一個途徑是提供帶有無菌罩或者可匹配標準尺寸無菌罩的細胞分揀儀。
有幾種可增強流體流動的技術，如聲學對焦 (Life Technologies公司)、等壓射流 (Stratedigm公司)、毛細管(Millipore公司)，或微流控技術（幾個還在開發中）。它們大多已在其他設備上應用，卻未必已用于流式細胞 儀。為便于使用者獲得及時反饋，我建議本文讀者加入 普渡大學流式細胞儀訂閱。許多流式細胞儀方面的領軍人物都會定期在該論壇上提供有價值的信息。其他博客，比如Google+，也有類似功能，但它們缺乏普渡團隊的深度和廣度。
另外，還有一些有意思的技術在這一領域也很有影響。首先，利用Miltenyi或其他公司的磁珠對目的細胞做預純化或清洗可提高分揀效率。當然，僅僅利 用一輪或多輪磁珠篩選而不用流式細胞儀，許多研究也能開展起來，但這不是本文討論的重點。Amnis 公司已將流式細胞儀射流與熒光顯微鏡和數字成像整合在一起。其結果是一系列單個細胞的圖像能夠顯示熒光團的分布，而非簡單的平均熒光指數（MFI）。 DVS Sciences已極大地擴展了可用質譜（MS）檢測結合報告抗體的金屬螯合物的靶標數。目前有33種不同的金屬可被同時檢測。該儀器被Time of Flight 稱為"Cytof"  [1]。考慮購買該儀器的研究人員應該確保他們有這一深度的細胞分析需要。此外，細胞在等離子體中會被汽化，所以用于研究的細胞不能恢復。
細胞分揀儀制造商有一點不能達成共識，激光檢測是在細胞通過噴嘴后的液滴中（空氣中的蒸汽），還是液滴形成前的流動細胞內，完成效果好。如圖1， （上圖）一個蒸汽系統（Influx，也可能是FACSCalibur或其他設備），（下圖）一個流動細胞系統（BD公司的 FACS Aria III）。

圖 1. 蒸汽的（頂部）和流動的（底部）細胞分揀裝置的光學構造。BD Biosciences?轉載許可。

這兩者各有優勢和局限。蒸汽分揀儀硬件設備簡單，檢測點與收集裝置間距離較短，檢測樣品的激光數多。而流動細胞分揀系統通過比色皿提供層流和增強的樣品 聚焦。然而，流動細胞長度有限，而且激光光學裝置需要足夠空間避免不同通道間的串擾。對于敏感性來說，流動細胞系統明顯占優，但蒸汽系統沒有保持細胞清潔 的問題，并且能提供額外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身對細胞有毒害作用。
細胞懸浮于液滴中，然后使其經主脈沖自由下滴（或提供壓力）。有關液滴如何帶點和偏向的問題，請參考Labome其他流式細胞儀的文章 圖7。
此外，關于培養基種類和細胞存活體積的問題。相關文章和普渡大學有大量關于培養基的建議，但培養基通常會選用牛胎兒血清（FBS）。將細胞收集到 11 x 75 毫米或更大的管中，需要用到0.5 - 1 mL的牛胎兒血清。對于多層平板來說，牛胎兒血清應該占一半的體積，因為還要考慮平板干掉的問題。而如果僅僅是收集核酸，用于細胞裂解和核酸提取的同樣的 產品就可以了。此外還建議對進一步處理的細胞在營養豐富的生長培養基中進行復蘇。
所有的流式細胞儀制造商都在增加分揀細胞存活方面取得了很大的進步。微流體方面的新進展可能使不通過液滴形成做細胞收集成為現實。不管答案是否是毛細管-基礎系統或基于微通道的系統，都必將規避分揀時的細胞壓力問題。

試劑-抗體

除非你用病人血清建立診斷檢測，不缺少提供流式細胞儀抗體的公司。請見Labome文章 列表。然而，并非所有這些公司都有相同克隆-并且不是所有克隆在流式細胞分析中作用方式相同。如果文章中沒有列出想要的克隆，而你又想運行相似的實驗，請作者找出使用的哪一克隆。
多數公司不會公開抗體純化和標記的方法，但如果你是從一個聲譽較好的公司購買，同一克隆標記相同的熒光基團就可以了，除非是在發貨途中受損，微生物污染或者保存不當。按照制造商建議的儲存條件，抗體至少能保質一年。
然后，你應該決定你的實驗是否要用熒光直接標記的抗體，或者用二抗，生物素-鏈霉親和素，或其他配體-受體。除非您的實驗室預算緊張，應使用直接標記的抗體。直接標記的抗體背景較低，沒有裂解細胞釋放的生物素造成干擾，重復性較好。
另一種選擇是用標記試劑盒或者第三基團標記的抗體，如 SoluLink或其他的。一些抗體制造商也提供用戶定制標記，但應認真考慮公司在抗體標記方面的聲譽如何。所有的化學基團各有優劣，因此需要慎重考慮交聯劑（請見Thermo Fisher Pierce   實用指南。
有五種基本類型的熒光染料：小分子染料（如熒光異硫氰酸酯/ FITC和Alexa染料），蛋白染料（藻紅蛋白、別藻藍蛋白、綠色熒光蛋白），串聯染料，其中蛋白染料收集熒光，將它傳輸至小分子染料，然后串聯染料發 出同小分子染料（如APC-Cy7）量子點和多聚染料(  亮紫)相同波長的光波。所有的都各有優點和缺點，但蛋白染料和小分子染料在流式細胞儀中使用時間最長。
我們很容易就能觀察到標記的大分子蛋白（> 100 kD）、疏水性染料或聚合物是如何改變單克隆抗體活性的。為說明相對相對大小，圖2顯示了一個抗體分子與一個蛋白分子共軛的結構（在這種情況下辣根過氧化 物酶“只有”44 kD）。我們可以得出這樣的結論：最安全的方法是使用以前別人用過的同一克隆抗體和熒光染料結合的抗體。但是，我們為什么不能創造出一種獨特的抗體呢-通 過表達細胞或非表達細胞共軛組合并表征其特異性，然后滴定抗體zui大化其信噪比，這樣你的實驗室就有一個新的試劑了。

圖 2. 

試驗中選擇熒光染料基于以下幾點：

1）流式細胞儀或細胞分揀儀上可以用什么樣的激光器和濾波器

2）目標相對豐度-更亮的熒光染料應該用在低豐度的分子上

3）靶標是否在細胞內。胞內靶標被包埋于細胞中，所以應該使用zui亮的熒光染料兩種激光儀器，比如Guava? EasyCyte 或者BD? FACSCalibur 只能使用四種熒光染料，所以染料選擇就像設置一個可用熒光染料基質并設其為檢測目標一樣簡單。PE通常是zui亮的，其次是APC，因此它們應該被連接到胞內 或低豐度的抗體上。想了解發射光溢出量，例如PE通道中的異硫氰酸熒光素，我們可以參考光譜分析 Invitrogen公司或者 BD公司。

如果超過兩種激光/四種顏色，我們就必須考慮自動還是手動補償了。 [2]   [3] Fluorescence minus One (FMO)可以控制 [4] 分析儀器-特定波長、強弱和熒光染料的重組。對于這些問題，我建議閱讀相關文獻并咨詢您的流式核心管理層和內部專家。


試劑 - 固定劑和通透緩沖液
  使用的固定劑幾乎都是多聚甲醛、PFA或者甲醛。這三種名字的固定劑都會用到，但其活性成分是相同的。固定劑應在磷酸鹽緩沖液（PBS）中稀釋至1-4%，固定過程通常在冰上進行。如果是激酶或磷酸蛋白，其磷酸酶需要迅速失活，因此PFA通常在37℃下使用。
甲醛可與伯胺作用，因為抗體含有結合位點通常帶有靜電相互作用，賴氨酸固定修飾可避免抗體與固定蛋白結合。這也是為什么根據已有實驗方案可以節省時間和 試劑的原因。顯然，固定（包括通透）會迅速殺死細胞，因此如果下一實驗步驟是細胞分級分離或核酸提取，通常會先對固定細胞進行分揀操作。
根據目標抗體是否分泌并在高爾基體內滯留，激酶或磷酸化蛋白是否需要磷酸酶抑制劑，核蛋白是否需要磷脂雙分子層部分溶解和DNA松弛，細胞透化需要選擇不同的方式。所有這些方法都會用到去污劑或酒精，去污劑zui溫和，而酒精特別是甲醇最強效。
當目標在胞質內時，首先需要用到zui溫和的去污劑皂素。低濃度，通常0.1%的皂素，對胞內細胞因子著色就足夠了 [5]。一些非離子去污劑，如Triton X-100、吐溫80也有使用，但皂素是最常見的選擇。
對于激酶和磷酸化蛋白來說，相關技術來自斯坦福大學的Gary Nolan 實驗室 [6]   [7]。磷酸酶被PFA和預冷酒精滅活，酒精也可以作為二次固定和強效通透的試劑。文章中建議70%-100%濃度的酒精，而70%和90%濃度的酒精zui常見。也有通透前先染色的例子。在去污劑和酒精中滴定抗體的-基于協議，可以在 Cytobank找到。分析深度的例子請見圖3。 

圖 3. 典型的Cytobank數據庫熱圖

用甲醇或乙醇作為透化劑可以作用核內目標。乙醇對于擴增細胞-特異性作用于Ki-67更好一些  [8]，但甲醇用的更多。并非所有抗體都結合PFA-甲醇固定細胞，因此許多單抗供貨商會提供一個相容性的表。然而，如果熒光劑是蛋白，在細胞用抗體染色前必須確保甲醇已經去除干凈，因為很多蛋白對醇類的脫水作用比較敏感。

醇類脫水作用的另一個受害者是那些細胞內表達用于流式細胞分析的熒光蛋白。它們包括綠色熒光蛋白、mCherry和Cerulean3。如果熒光信號被醇類處理破壞，就需要用到熒光蛋白抗體來檢測變性熒光蛋白了。

試劑-染料

 非結合染料在 早年是 *種用于流式細胞分析的細胞染色試劑。下面介紹的用到的染料可以分成活體染料（vital dyes）、核酸插入染料（nucleic acid intercalating dyes）、譜系染料（lineage dyes）、陽離子和pH通道染料（cation and pH flux dyes）、外排染料（efflux dyes）和細胞器染料（organelle dyes）。只有zui常用的或者用到的染料才會被提及，如果想查看其他的來源，請參見 分子探針。備注：分子探針? 有15種染料。

活體染料

臺盼藍（Trypan Blue）是*種被發現不能進入活細胞而能自由進入死細胞的染料。PubMed上有一篇參考文獻提及它的使用可以追溯到1914年，*篇用于流式細胞 分析的文獻可以在上面Beckman Coulter鏈接中找到。而zui早將臺盼藍作為活體染料的文章可以追溯到1980年  [8]。從那以后，碘化丙啶（PI）和7-氨基放線菌素D（7-AAD）也被作為了活體染料的選擇 [9]。7-AAD在流式細胞分析中往往較少會外溢到臨近的通道中，因此明亮的DNA染料和另一種柔和的并且有重疊發射光譜的熒光分子一起使用的時候，一定要多加小心。