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  • 發布時間:2019-10-02 20:25 原文鏈接: 銀染核仁形成區的光鏡和電鏡標本制備及觀察

    實驗原理

     

    在細胞分裂中期核型中,人的端著絲粒染色體短臂區和在間期細胞核的核仁中有與銀離子特異親合物質,通過銀染可以顯示它們的致量,因此一直被人們所關注。近年來發現,雖然人的端著絲粒染色體短臂是 28S、18S、和 5.8S rRNA 基因存在部位,稱核仁形成區(Nucleolar organizer region,NOR),但銀染的物質不是 rDNA 和 rRNA,而是與活性的 rDNA轉錄有關的一類酸性蛋白質,容易將 Ag 離子還原為 Ag 的顆粒,從而在核仁形成區鍍上銀、呈棕黑色,稱為銀染核仁形成區(Silver—Staining nucleolar organizer region,Ag—NOR)。生化和免疫化學研究證明銀染蛋白是RNA聚合酶I,其功能是催化rDNA轉錄rRNA形成核仁,因此通過這種反應能夠特異顯示 rRNA 轉錄的活性。

    由于銀染核仁形成區方法簡便、特異性強,目前在遺傳、腫瘤、藥物毒理及預防醫學等細胞生物學研究中,均有廣泛應用。特別是電鏡銀染活性核仁形成區技術,可以在同一個細胞中顯示銀染蛋白、活性 rDNA 和 rRNA 三者間關系,并在亞細胞水平進行分析。

    實驗試劑

     

    Carnoy 固定液(用時現配)、5N HCl、0.1%甲酸、l%甲酸、50%AgNO3 (用時現配)、2%蛋白膠、5%硫代硫酸鈉、2.5%戊二醛、30%~100%梯度乙醇和丙酮、Epon一812 包埋劑、醋酸鈾和檸檬酸鉛染液、蒸餾水。

    實驗設備

     

    顯微鏡、電子顯微鏡、超薄切片機、水浴箱、離心機、天平、染色缸、平皿、乳頭吸管、離心管、擦鏡紙。

    實驗材料

     

    人外周血淋巴細胞核型標本、HL一60 細胞、HeLa 細胞。

    實驗步驟

     

    1. 中期染色體核仁形成區的銀染和觀察

        (1) 取制備好的正常或腫瘤細胞染色體標本,直接放入裝有 5N HCl 溶液中,常溫處理 5分鐘;

        (2) 用自來水反復沖洗幾次,甩干,標本面朝上平放在平皿中;

        (3) 將 0.1%甲酸臨用前配制的 50%AgNO,溶液約 0.5ml,用吸管滴在標本上,再蓋上二片擦鏡紙;

        (4) 放置平皿于 56℃水浴中處理 3~5 分鐘,待擦鏡紙呈棕色后,取出標本用水沖洗、氣干;

        (5) 鏡檢。

    鏡下所見標本背景淺黃色,核型深染,端著絲粒染色體的銀染蛋白存在的部位呈棕黑色顆粒,選擇染色體分散良好,銀染顆粒清楚的分裂相,進行計數單側或雙側有銀染顆粒的染色體數。

    人體細胞銀染顆粒有遺傳穩定性,一般正常值為4~8 個/核型。

    計算方法

    NOR 均值=N 個核型中含 NOR 染色體數的和/N 個核型

    2. 間期細胞核活性核仁形成區的銀染與觀察

        (1) 收集培養的 HL—60 細胞和用 PHA 轉化的人正常外周血淋巴細胞分別于離心管中,用 1000rpm 離心 5 分鐘后棄上清;

        (2) 用吸管吸打或用指彈法使細胞懸浮,然后用 Carnoy 固定液固定 30 分鐘;

        (3) 以 1000rpm 離心 5 分鐘,棄上清剩約 0.5~0.1ml 液體,使細胞懸浮后滴片;

        (4) 37℃干燥 24 小時;

        (5) 銀染(程序同前);

        (6) 鏡檢。

    鏡下所見,細胞核著色而細胞質不著色,核中活性核仁形成區銀染顆粒呈棕黑色,成簇聚集,清晰可分。腫瘤細胞中與正常細胞中的銀染顆粒數量、可見有明顯差異。

    3. 間期細胞核銀染活性核仁形成區電鏡標本制備與觀察

        (1) 收集培養的 HL--60 細胞或 HeLa 細胞于離心管中,隨后加入 2.5%戊二醛 1ml 預固定 10 分鐘;

        (2) 以 1000rpm 離心 10 分鐘,棄上清后加入 Carnoy 固定液固定 5 分鐘;

        (3) 接著以 2500rpm 離心 l0 分鐘,棄凈上清并用吸水紙吸干殘余液體,用耳勺取出細胞團塊放于小平皿中;

        (4) 100%乙醇&rarr;雙蒸水梯度復水,每步 5 分鐘;

        (5) 然后將細胞團切成約 1mm 3 大小的塊;

        (6) 將 50%AgN03(用蒸餾水配制)—2%蛋白膠(用 1%甲酸配制)2:1 混合液 2~3ml,加入有細胞團塊的小平皿中;

        (7) 移置平皿于 56℃水浴中處理 20 分鐘;

        (8) 徹底水洗 3 次,每次 2~3 分鐘;

        (9) 水洗后 5%硫代硫酸鈉室溫處理 l0分鐘;

        (10) 再水洗 3 次,轉入乙醇一丙酮梯度脫水,每步 5 分鐘;

        (11) Epon812 包埋;

        (12) 超簿切片直接地或再經醋酸鈾和檸檬酸鉛復染后,在電鏡下觀察。

    鏡下所見,經鈾、鉛復染的標本,細胞核中電子密度大的是核仁纖維中心(Fibrillar

    Centre,FC)和致密纖維成分(Dense fibrillar component,DFC)它們是銀染蛋白和正在轉錄的 rRNA 基因存在的部位;周圍電子密度均勻,著色淺的為 rRNA 前體和核糖體大、小亞單位存在的顆粒成分(Granular component,GC)。

    超薄切片不經鈾、鉛復染,直接在透射電鏡下觀察,顯示銀染蛋白顆粒只存在于 FC 和DFC 中,在周圍 GC 中很少存在。


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