原理
免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸（ HAuCl4 ）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。
膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如 SPA 、 PHA 、 ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
膠體金的制備
根據不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。
1 ．枸櫞酸三鈉還原法
（ 1 ） 10nm 膠體金粒的制備：取 0.01 ％ HAuCl4 水溶液 100ml ，加入 1 ％枸櫞酸三鈉水溶液 3ml ，加熱煮沸 30min ，冷卻至 4 ℃ ，溶液呈紅色。
（ 2 ） 15nm 膠體金顆粒的制備：取 0.01 ％ HAuCl4 水溶液 100ml ，加入 1 ％枸櫞酸三鈉水溶液2ml ，加熱煮沸 15min ～ 30min ，直至顏色變紅。冷卻后加入 0.1Mol/L K2 CO3 0.5ml ，混勻即可。
（ 3 ） 15nm 、 18nm ～ 20nm 、 30nm 或 50nm 膠體金顆粒的制備：取 0.01 ％ HAuCl4 水溶液100ml ，加熱煮沸。根據需要迅速加入 1 ％枸櫞酸三鈉水溶液 4ml 、 2.5ml 、 1ml 或 0.75ml ，繼續煮沸約 5min ，出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為 15nm 、 18 ～ 20nm 、 30nm 和 50nm 。
2 ．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法
A 液： 1 ％ HAuCl4 水溶液 1ml 加入 79ml 雙餾水中混勻。
B 液： 1 ％枸櫞酸三鈉 4ml ， 1 ％鞣酸 0.7ml ， 0.1Mol/L K2 CO3 液 0.2ml ，混合，加入雙餾水至20ml 。
將 A 液、 B 液分別加熱至 60 ℃ ，在電磁攪拌下迅速將 B 液加入 A 液中，溶液變藍，繼續加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為 5nm 。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表所列的數字調整鞣酸及 K2 CO3 的用量。
鞣酸—枸櫞酸鈉還原法試劑配制表
金粒直徑 （ nm ） | A 液 | B 液 | ||||
1 ％HAuCl4 | 雙餾水 | 1 ％枸櫞酸三鈉 | 0.1Mol/L K2CO3 | 1 ％鞣酸 | 雙餾水 | |
5 | 1 | 79 | 4 | 0.20 | 0.70 | 15.10 |
10 | 1 | 79 | 4 | 0.025 | 0.10 | 15.875 |
15 | 1 | 79 | 4 | 0.0025 | 0.01 | 15.9875 |
3 ．制備高質量膠體金的注意事項
（ 1 ）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結合和活化后金顆粒的穩定性，不能獲得預期大小的金顆粒。
（ 2 ）試劑配制必須保持嚴格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經超濾或微孔濾膜（ 0.45 μ m ）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質。
（ 3 ）配制膠體金溶液的 pH 以中性（ pH7.2 ）較好。
（ 4 ）氯金酸的質量要求上乘，雜質少。最好是進口的。
（ 5 ）氯金酸配成 1 ％水溶液在 4 ℃ 可保持數月穩定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解。
膠體金標記蛋白的制備
膠體金對蛋白的吸附主要取決于 pH 值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的 pH 值低于蛋白質的等電點時，則會聚集而失去結合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等都影響膠體金與蛋白質的結合。
1 ．待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預先對 0.005Mol/L pH7.0 NaCl 溶液中 4 ℃ 透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后 100 000g 4 ℃ 離心 1h ，去除聚合物。
2 ．待標膠體金溶液的準備 以 0.1Mol/L K2 CO3 或 0.1Mol/L HCl 調膠體金液的 pH 值。標記 IgG時，調至 9.0 ；標記 McAb 時 , 調至 8.2 ；標記親和層析抗體時，調至 7.6 ；標記 SPA 時，調至 5.9 ～6.2 ；標記 ConA 時，調至 8.0 ；標記親和素時，調至 9 ～ 10 。
由于膠體金溶液可能損壞 pH 計的電板，因此，在調節 pH 時，采用精密 pH 試紙測定為宜。
3 ．膠體金與標記蛋白用量之比的確定
（ 1 ）根據待標記蛋白的要求，將膠體金調好 pH 之后，分裝 10 管，每管 1ml 。
（ 2 ）將標記蛋白（以 IgG 為例）以 0.005Mol/L pH9.0 硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為 5 μ g/ml ～ 50μ g/ml ，分別取 1ml ，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加 1ml 稀釋液。
（ 3 ） 5min 后，在上述各管中加入 0.1ml 10 ％ NaCl 溶液，混勻后靜置 2h ，觀察結果。