第七章 電子顯微鏡免疫細胞化學技術
第一節 電子顯微鏡免疫細胞化學技術概述
免疫細胞化學技術為在細胞水平上研究免疫反應做出了貢獻，但由于光學分辨率的限制，不可能從細胞超微結構水平觀察和研究免疫反應。因此，Singer于1959年首先提出用電子密度較高的物質鐵蛋白（ferritin）標記抗體的方法，為在細胞超微結構水平研究抗原抗體反應提供了可能。在此基礎上，相繼發展了雜交抗體技術、鐵蛋白抗鐵蛋白復合物技術、蛋白A-鐵蛋白標記技術、免疫酶技術及膠體金技術等。電子顯微鏡免疫細胞化學技術（以下簡稱免疫電鏡技術技術）區別于免疫細胞化學和常規電鏡技術主要在以下幾方面：
一、組織固定與取材
在這方面的要求是即要保存良好的細胞超微結構，又要注意保持組織的抗原性。因此，選用固定劑不宜過強。常用的免疫電鏡固定劑有多聚甲醛―戊二醛混合液和過碘酸-賴氨酸―多聚甲醛液（Periodate―Lysine ?Paraformaldehyde簡稱PLP液）。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液（其配制法見附錄）。國外不少文獻推薦應用PLP液于免疫電鏡技術，認為該固定液對含糖類豐富的組織固定效果特佳，因為組織抗原絕大多數由蛋白質和糖兩部分組成，抗原決定簇位于蛋白部分，有選擇性地使糖類固定，就可使抗原性穩定。PLP液中過碘酸能氧化糖類，使其產生醛基，再經賴氨酸作用，使新形成的醛基分子間和分子內相互連接，穩定組織抗原。但賴氨酸價格較貴，不如多聚甲醛戊二醛固定液經濟、簡便、效果佳。在取材方面，免疫電鏡技術較光鏡免疫化學技術要求更迅速、精細。
二、免疫染色
分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。
1．包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取出，修整成小塊，按常規電鏡方法處理，經鋨酸固定、脫水、包埋。如果特異性免疫反應的范圍太小，為了準確定位，可作第二次包埋，即第一次包埋時將組織置于兩層thermanox塑料片之間，中夾環氧樹脂如夾心面包式，進行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的組織，以中層較為理想。表層因受機械修整，結構往往保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應弱或無。在作超薄切片前應先切半薄切片，尋出免疫反應陽性部位。根據作者經驗，半薄切片可在相差顯微鏡下不染色進行觀察（指PAP染色法），免疫反應部位呈黑點狀。在HE或甲苯胺藍染色的半薄切片上，免疫反應部位呈棕黃色。據此定位作超薄切片，可大大提高陽性反應檢出率。為避免電鏡鉛、鈾染色反應與免疫反應之間的混淆，可取相連續的起薄切片，分別以兩個銅網撈取，其中之一進行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進行對照觀察。
包埋前染色法的優點是：①切片染色前不經過鋨酸后固定、脫水及樹脂包埋等過程，抗原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應。②可在免疫反應陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率。特別適用于含抗原量較少的組織，但由于經過一系列的免疫染色步驟，常出現一定的超微結構損傷。
2．包埋后染色 組織標本經過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后，再進行免疫組化染色。由于是以貼在網上的超薄切片進行免疫染色，故又名之載網染色（on grid staining）。必須指出的是：①后固定中是否應用四氧化鋨存在不同意見，作者經驗一般以不用四氧化鋨為佳，或盡量縮短在四氧化鋨中停留的時間。有作者認為，從理論上講，四氧化鋨具有保存抗原的作用，但實踐證明應用四氧化鋨可使抗原活性明顯減低。②在載網染色過程中，銅網易與化學物質產生反應，故需選用鎳網或金網。③在免疫組化處理的全過程中，應注意保持網面的濕潤，網面干燥會影響抗體活性。本法的優點是超微結構保存較好，方法簡便，陽性結構有高度的可重復性，還能在同一張切片上進行多重免疫染色。但抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；環氧樹脂中的環氧基，在聚合過程中可能與組織成份發生反應而改變抗原性質；包埋在環氧樹脂中的環氧基，在聚合過程中可能與組織成份發生反應而改變抗原性質；包埋在環氧樹脂中的組織不易進行免疫反應等。因此，免疫組化工作者曾試圖以不同的方法如飽和苯溶液，無水酒精中NaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等以減少或去除包埋劑，取得不同程度的效果。現普遍采用的是在進行免疫染色前，以H2O2液蝕刻數分鐘，以去鋨和增強樹脂的穿透性。
3．超薄冰凍切片 按照Tokuyasu建立的方法，將組織置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機上切片，切片厚度可略厚于常規樹脂切片。冰凍超薄切片由于不需經固定、脫水、包埋等步驟，直接進行免疫染色，所以抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優點。
三、包埋
（一）樹脂包埋
國內現普遍采用的是環氧樹脂包埋法，可直接脫水后包埋，也可將小片組織或半薄切片貼在載片上，將充滿環氧樹脂的明膠囊倒置于切片上聚合、硬化，進行原位包埋。
（二）低溫包埋
常規樹脂包埋由于需高溫聚合等處理程序，組織抗原性可能全部或部分丟失。因此，在免疫電鏡技術方面，國外不少實驗室已開始采用低溫技術如低溫包埋和冰凍超薄切片等，后者需配備冰凍超薄切片機，且技術難度較大，不如低溫包埋法易推廣。低溫包埋劑的研究開始于60年代，80年代免疫細胞化學技術在電鏡水平上的廣泛的應用，為低溫包埋劑的實驗研究開辟了廣闊的領域。國內已有較多的應用報道，國內一些實驗室已開始摸索。作為低溫包埋劑的多為乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycolmethacrylate,GMA）,Lowicryls, LR White和Lr Gold等，目前國外生產廠家有Polysciences INC , Reichert―Jung 和LKB等系列產品。現將常用的幾種低溫包埋劑及其應用簡單介紹如下：
1．Lowicryls 是丙烯酸鹽（acrylate） 和甲基丙烯酸鹽（methacrylate）化學物質，包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列產品（Polysciences INC），其特點是能在低溫下保持低粘度（K4M：--35℃；HM20：-70℃；K11M、HM23：-60℃～-80℃）和具有在光照射（紫外光，波長360nm）下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無度。其中K4M和K11M具有親水性，特別適合于免疫細胞化學的應用，因它能較好地保持組織結構和抗原性，減少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能產生高反差圖像，適用于掃描、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作。所有這些種類的低溫包埋劑都適用于冰凍置換技術。K4M的應用和報道較多，現側重介紹如下：
（1）包埋劑的配制：商品提供的Lowicrys包埋劑由三個部分組成：單體（Monomer），交聯劑（Crosslinker）和引發劑（Initator）。調整單體和交聯劑的比例，增加交聯劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：
K4M：單體 17.30g
交聯劑 2.70g
引發劑 0.10g
K11M：單體 19.00g
交聯劑 1.00g
引發劑 0.10g
作者的經驗，可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒輕攪3～5min或用一小管通入液氮氣泡以攪拌之。勿過分攪拌，以防氧的氣泡進入包埋劑中。
（2）生物樣品處理程序（Lemanski 等1985）
①動物麻醉取材，以多聚甲醛―賴氨酸―過碘酸鈉在9℃固定2h。
②磷酸緩沖液含7%蔗糖，pH7.2,沖洗過夜，0℃
③0.1mol/L 磷酸緩沖液，pH7.2,沖洗，0℃
④脫水：65%乙醇，1h ,0℃
80%乙醇，2h,-35℃
Lowicryl K4M：80%乙醇=1：11h -35℃
Lowicryl K4M：80%乙醇=2：11h -35℃
100% Lowicryl K4M 1h -35℃
100% Lowicryl K4M 過夜-35℃
⑤包埋：新鮮K4M置于膠囊內，將組織移入，在-30℃～-40℃以紫外線燈波長360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT）相距30～40cm照射24h使之聚合。如為100W燈泡，照射距離應大于85cm。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。
（3）免疫染色
①切片（厚50～70nm）貼在金網或覆有碳膜的鎳網上。所有下列步驟在室溫、濕盒內進行。所有溶液需經微孔濾紙（0.25～0.45μm）濾過。
②正常羊血清30min。
③第一抗血清（PBS稀釋），37℃2h。
④可用燒杯法（或塑料壺噴洗法），以鑷夾鎳網在第一燒杯中洗蕩30min，然后在第二燒杯中洗蕩1h 。
⑤正常羊血清30min。
⑥第二抗血清（膠金標記抗體）以正常羊血清稀釋為1：1，以鎳網置于血清滴上孵育1h。
⑦沖洗如④。
⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。
⑨沖洗如④。
