細胞凋亡的圖片5
細胞凋亡的圖片6
細胞凋亡的研究方法
一、定性和定量研究
只定性的研究方法：常規瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察（普通光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）
進行定量或半定量的研究方法：各種流式細胞儀方法、原位末端標記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。
二、區分凋亡和壞死
可將二者區分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態學觀察（透射電鏡是是區分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細胞儀檢測，AnnexinV/PI雙染色法流式細胞儀檢測等。
不能將二者區分開的方法：原位末端標記法、PI單染色法流式細胞儀檢測等。
三、樣品來源不同選擇
組織：主要用形態學方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標記，ELISA或將組織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。
培養的細胞：幾乎所有方法
1、早期檢測:
（1）PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測
（2）細胞內氧化還原狀態改變的檢測
（3）細胞色素C的定位檢測
（4） 線粒體膜電位變化的檢測
2、晚期檢測：
細胞凋亡晚期中，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。
對于晚期檢測通常有以下方法：
（1）TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)
（2）LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)
（3） Telemerase Detection (端粒酶檢測)
形態學觀察
普通光學顯微鏡觀察；透射電子顯微鏡觀察；熒光顯微鏡觀察
普通光鏡下觀察：
用蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失
Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細胞核的色澤均一，凋亡細胞染色變深，壞死細胞染色淺或沒染上顏色
直接用倒置顯微鏡觀察：細胞體積變小，全面皺縮；凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。
透射電子顯微鏡觀察：
凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
熒光顯微鏡
常用的熒光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB。其中Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
注意事項
細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。
生化檢測
典型的生化特征：DNA 片段化
檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記（TUNEL）等
TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）
通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。
LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)
當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結合其它的方法來檢測細胞凋亡。
其它方法：
Telemerase Detection (端粒酶檢測)
端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。
mRNA水平的檢測：
研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。
細胞內氧化還原狀態改變的檢測：
正常狀態下,谷光苷肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。
細胞色素C的定位檢測：
細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
線粒體膜電位變化的檢測：
線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關系。近年來陸續有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內膜的通透性轉變，這是由于生成了動態的由多個蛋白質組成的位于線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道(PT孔道)能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據：若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，并不導致細胞核的變化。但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。