做RT也做了幾次,有成功也有失敗,在園子中受益良多,把我自已的一個流程放上來,供大家參考.
細胞RT-PCR操作流程
實驗流程
一 、取RNA：
1、 處理細胞：
（1） 貼壁細胞：先用無菌DEPC水配制的PBS洗細胞兩次，棄盡PBS后，直接向培養瓶中加入1ml Trizol，通過溶解細胞，通過移液管分次移出細胞裂解物。當Trizol量不足，可導致RNA中有DNA污染。
（2） 懸浮細胞：先用無菌DEPC水配制的PBS洗細胞，通過離心沉淀細胞，在Trizol中移液管反復吹打來裂解細胞，每107細胞加入1ml Trizol。
2、 冰浴5分鐘，充分分解核蛋白體，加入0.2ml氯仿，劇烈顛倒混勻15秒。
3、冰浴10分鐘，4℃ 12000rpm,15分鐘。
4、仔細取上層水樣層（體積大約為所加Trizol的60%）轉入新EP管，萬勿吸到蛋白。
5、加入0.5ml異丙醇,顛倒混勻后，25℃放置10分鐘.
6、4℃,12000rpm,10分鐘(或可見膠狀片狀沉淀于管底),小心移去上清.
7、75%乙醇1ml沉淀RNA(與Trizol等量),震蕩混勻樣品.
8、4℃,12000rpm,5分鐘,盡可能徹底地吸盡上清,但要防止丟失RNA沉淀,靜置以揮發乙醇.
9、DEPC水30ul 溶解RNA,并在55℃條件下孵育10分鐘助溶。
二、紫外光檢測：
紫外光檢測260nm與280nm吸光度，計算RNA濃度與A260/280（factor:select—RNA---ref.）,比值最好大于1.65(不過我有幾次小于此值也出來了,大于此值也有沒批出來的時候)
三、RT-PCR(試劑盒為MBI)制備cDNA第一條鏈：（promega）
1、 于PCR管中加入：
總RNA 0.5-5ug(5ul)
oligo(dT)18 1ul
加水 Xul
至總體積為12ul，輕輕混勻
2、 于PCR儀上70℃ 5分鐘，稍離心。
3、 5×Buffer 4ul .
RNAase 抑制劑 1ul
10mM dNTP 2ul，輕輕混勻，
4、 37℃ 5分鐘，稍離心，
5、 加入M-Mulv 1ul
總體積20ul
6、 25℃ 10分鐘
42℃ 60分鐘
70℃ 10分鐘
取出PCR管，-70℃保存，或直接應用于PCR合成
PCR的反應根據各人條件不同 ,各自設定,但我自已覺的做TOUCH DOWN比較好,而且TM變化不要超過5度.