首先引物要跟模板緊密結合，其次引物與引物之間不能有穩定的二聚體或發夾結構存在，再次引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應（即錯配）。圍繞這幾條基本原則，設計引物需要考慮諸多因素，如引物長度（primer length）、產物長度（product length）、序列Tm值（melting temperature）、ΔG值（internal stability）、引物二聚體及發夾結構（duplex formation and hairpin）、錯誤引發位點（false priming site）、引物及產物GC 含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等。以使用Oligo 軟件分析設計引物為例，筆者總結出以下的要點：
1. 引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，即Taq 酶的最適溫度。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的堿基一般不用A（3’端堿基序列最好是G、C、CG、GC），因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。另外引物間3’端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR 影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。
3. 引物的GC含量一般為40-60%，以45-55%為宜，過高或過低都不利于引發反應。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5’端增加Gs或Cs。但也有認為：原來普遍認為PCR引物應當有50%的GC/AT比率的觀點其實是不對的，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產生單一的、專一的、長250 bp，含有70% AT的產物。完全沒有必要復雜地去計算產物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。
4. 引物所對應模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲線以選取72 度附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發聚合反應），至少要在55-80℃之間
5. ΔG值（自由能）反映了引物與模板結合的強弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超過9（ΔG值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發反應而可防止錯誤引發。3′末端雙鏈的ΔG是0~-2 kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在-6時只有40%、到-8時少于20%、而-10時接近于0。
6. 可能的錯誤引發位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發率高，錯誤引發的引發率一般不要高過100，如此可保證不出現非目的產物的假帶。但對于特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為450 以上，而在錯誤位點的引發效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對引物也是可以接受的。
7. Frq 曲線為Oligo6新引進的一個指標，揭示了序列片斷存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用Frq 值相對較低的片斷。
8. 引物二聚體及發夾結構的能量一般不要超過4.5，否則容易產生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導致PCR 正常反應不能進行，與二聚體相關的一個參數是堿基的分布，3’端的連續GGG 或CCC 會導致錯誤引發。二聚體形成的能值越高越穩定，越不符合要求。與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。雖然有些帶有發夾環，其ΔG為-3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3′末端被發夾環占據時就很麻煩，即會引發引物內部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數量。當然，如果發夾環在5′末端對反應就沒有多大的影響了。
9. 以公式（4×G/C + 2×A/T-5）計算Tm值，即退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度。4-6℃的差別似乎對PCR產量影響不大。最好，保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內。