Gateway也可以被視為一種克隆操作平臺：把目的基因克隆到入門載體（Entry Vector）后，就不用依賴限制性內切酶，而靠載體上存在的特定重組位點和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（Destination Vector，目的載體）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌體DNA定點整合到細菌宿主基因組上。在噬菌體和細菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位點和大腸桿菌基因組的attB位點可以發生定點重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側產生兩個新位點：attL和attR。
這是一個可逆的過程，如果在一個噬菌體編碼蛋白Xis和IHF、Int的共同介導下這兩個新位點可以再次重組回復為attB和attP位點，噬菌體從細菌基因組上裂解下來。這一過程的方向是受控于兩個重要因素：存在的介導蛋白和重組位點。
在Gateway系統中,入門載體包含兩個重組位點序列attL1和attL2，大小均為100bp，中間夾著一個自殺基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表達產物能抑制普通的E.coli生長，在克隆時沒有切開或者自身環化的載體在轉化時不能生長。
在構建含目的基因的入門載體時必須切掉這個基因，接入目的基因。ccdB基因兩端可以選擇的酶切位點有限（2個），同時還必須考慮讀碼框架、啟動子、終止密碼等問題，因此Gateway系統提供了5種不同的入門載體以供選擇。需要特別注意的是轉化用的菌株必須是不含F附加體的，因為它表達的一種產物能阻斷ccdB基因，影響篩選結果。
同樣，目的載體（Destination Vector）也必須和Gateway系統配套，即目的載體的表達調控元件下游有兩個重組位點attR1和attR2，大小均為125bp，同樣也夾著一個ccdB自殺基因。
當需要將目的基因從入門載體（Entry Vector）轉移到目的載體（Destination Vector）時，只要將兩種質粒混合（線性化能有效提高重組率），加入含有Int、IHF、Xis等重組因子的LR重組酶混合物，attR2序列和attL2序列發生重組，生成一個融合質粒。
attL1序列再和attR1序列重組，融合質粒分解為兩個新的質粒，目的基因與原來位于目的載體上的自殺基因發生重組置換，得到一個帶目的基因的目的載體（生成新的重組位點attB1、B2）和帶自殺基因的入門載體（生成新的重組位點attP1、P2）。
反應過程需要25度保溫1小時（時間越長，重組率越高，特別是較大的質粒，反應過夜能提高5倍重組效率），蛋白酶K37度處理10分鐘，轉化。由于帶自殺基因的載體不能生長，加上抗生素篩選，轉化產物重組率高達90%以上。同樣，轉化用的菌株必須是不含F附加體的。
由于在這個反應中attL1序列只和attR1序列重組，attL2序列只能與attR2序列重組，這個方向的反應稱為LR反應。LR反應生成新的位點稱為attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。 在一定的條件下，attP和attB序列也能發生重組，生成attL和attR序列，這個反向反應稱為BP反應。
當用戶得到一個含目的基因的Gateway表達載體，希望將目的基因轉移到另外幾個Gateway表達載體中時，只要先將目的基因從Gateway表達載體中轉移到入門載體上，在由入門載體轉移到其它的表達載體就行。
將含目的基因的Gateway表達載體（attB1—目的基因—attB2序列）與帶有attP1-ccdB(自殺基因)-attP2序列的供體載體（pDONR，注意這個載體不同于入門載體Entry Vector）混合，加入含有Int、IHF的BP重組酶混合物，25度保溫1小時，37度蛋白酶K處理10分鐘，根據與上面相同的原理，attP和attB序列也能發生重組，生成帶有目的基因的入門載體（Entry Vector）和帶自殺基因的表達載體。
同樣，由于抗性不同以及自殺基因的作用，只有含目的基因的入門載體能被篩選出來。這即是BP反應。需要特別注意的是表達載體如果也是卡那霉素抗性，就必須選擇另外一個供體質粒以便篩選。
使用Gateway系統的第一步即為入門載體的構建，有以下幾種方法：
A、 PCR重組克隆
以下列方式合成PCR引物，即GGGG-attB1或者attB2序列（25bp）-基因特異性序列（18到25個堿基或以上），這樣在PCR擴增目的基因時就可以直接得到兩端帶有attB1/2基因的片斷。將PCR產物直接與上述的供體載體（帶有attP1-ccdB(自殺基因)-attP2序列）混合，加入BP重組混合酶，25度保溫1小時，再37度蛋白酶K處理10分鐘，即可轉化并得到帶有目的基因的入門載體。
當然，這個產物最后是需要測序鑒定的，并且，克隆到入門載體的基因不能表達，所以不能用抗體篩選檢測。還有一點值得注意的是，由于attB1的末端（第25個堿基）是T，所以跟在后面的基因特異性序列的頭兩位堿基不能是AA、AG和GA以免提前出現終止密碼。得到的入門克隆中，目的基因兩側具有attL重組位點，可以與任何Gateway?目的載體進行重組。
B、限制性內切酶消化
作為PCR克隆的替代方法，有5種Gateway?入門載體可以使用傳統的限制酶切和連接的方法產生入門克隆。這些載體配合合適的目的載體，可以用于表達天然蛋白或帶有N端或C端融合標簽的重組蛋白。為了在真核細胞中有效地翻譯蛋白，所有的5個Gateway?入門載體提供了Kozak 序列。此外，pENTR?11提供了SD (Shine-Dalgarno)序列，便于在大腸桿菌中有效的翻譯。
C Gateway?改造過的cDNA文庫
如果您已經有了用Gateway兼容載體構建的cDNA文庫，您就可以通過pDONRTM載體和BP ClonaseTM酶混合物進行一個簡單的重組反應，很容易地把單個克隆轉換成Gateway?入門克隆。這樣就不再需要亞克隆和測序，為您節約數小時的時間。SuperScript cDNA文庫使用pCMV·SPORT構建，有幾種的人組織來源可供選擇，這些文庫有很大一部分是全長的插入片段，可以完全代表來源mRNA。