Annexin V-PI 雙染法
在細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過程發生在DNA片段化之前，因而檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是相對分子質量為35 000大小的Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相結合。利用這一原理，可以將AnnexinV標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)來區分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。在流式細胞 儀的結果中可見AnnexinV-FITO+)、PI”’細胞為凋亡細胞，而AnnexinV-FITC(+) 、PI(+) 為壞死細胞。
AnnexinV-FITC-PI檢測凋亡的商品化試劑盒的發展很成熟，標記的過程相當簡單，效果也很好。試劑盒中一般包括標記好的AnnexinV-FITC、配好的PI染液(10mg／m1)和標記緩沖液(10X 0．1 mol／L Hepes／NaOH，pH7．4，1．4 mol／L NaCl，25 mmol／LCaCl2，使用前用去離子水稀釋至1X工作液)。
染色過程
(1)常規收集細胞，以冷的PBS洗兩次，以lX標記緩沖液重懸細胞至lXl06 細胞/ml
(2)吸取100／ll細胞(1X10‘)進行標記，加入5ul AnnexinV-FITC和5ul PI。
(3)將細胞混勻，在室溫下避光孵育15rain左右。
(4)每管中另加400／A1標記緩沖液，在1h內上樣。