26、PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別？
PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質的單克隆抗體生產培養基。如果作為雜交瘤生產培養基使用，PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是雜交瘤生產培養基，也是單克隆抗體生產培養基。它包含低水平的蛋白質。
27、在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少？
High Five無血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。
28、High Five細胞用多大的密度凍存？
3.0x106 cells/ml
29、在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2 mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。
30、如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？
我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性最小，生活力最高。正如手冊上所顯示，通過使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。 胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：
1. 去除培養基。
2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS。
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。
4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。
5. 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）
6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。
7. 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。
31、在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？
為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。
32、如何評估ES細胞合格的胎牛血清？
使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。 相關生長效率分析： 當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養基中，檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。 細胞毒分析： 當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。 相關形態學和分化分析： 檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿，顏色較淺。 所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的，培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。（ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。） 經過培養發現，大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。
33、在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？
通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候記數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。
34、如何選用特殊細胞系培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。
35、何時須更換培養基？
視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。
36、可否使用與原先培養條件不同之培養基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。
37、可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
38、何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
39、培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。
40、Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。
41、細胞之接種密度為何？
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
42、懸浮性細胞應如何繼代處理？
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。
43、冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。
44、細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
45、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于-20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。
46、欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000 rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。
47、細胞冷凍培養基之成份為何？
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。
48、DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4 °C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
49、冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 °C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。
50、細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
51、培養基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。
52、應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。、
53、如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？
原則上：直接滅菌后丟棄之。
當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1）在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2）分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。
3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。
5）在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6）重復步驟4。
7）在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。
54、支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。
55、支原體污染會對細胞培養有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。
56、偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。
57、CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
58、為何培養基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？
培養基保存于4 °C 冰箱中， 培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。
59、各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
60、購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。
61、購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80 °C 太久。
62、貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基，在放置幾天后顏色變紫?
這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。
63、 細胞培養基偶然被凍，可否繼續使用？
如果細胞培養基偶然被凍，您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生，培養基可以正常使用，如果出現沉淀，只能丟棄這些培養基。
64、無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎？
當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。
65、培養基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？
一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
66、培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎？
大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。
67、為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?
胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。
68、保存血清最好的方法?
我們建議血清應保存在-5 ℃至-20 ℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。
69、如何解凍血清才不會使產品質量受損?
將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8 ℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。