引物延伸分析（primer extension analysis）主要用于mRNA 5′端作圖。poly（A）+RNA首先與過量5′端標記的且與靶RNA互補的單鏈寡核苷酸引物雜交，然后用反轉錄酶延伸這個引物。產生的cDNA與RNA模板互補且長度與引物5′端和RNA 5′端之間的距離相等。該法在mRNA 5′端作圖方面具有下述優勢：一旦引物被子起始合成，延伸反應大多會進行到RNA模板的5′最末端，產物大小可精確測定。此外，產物長度不會受靶基因內含子分布與大小的影響。
幾乎所有的引物延伸實驗多采用長20~30 bp合成寡核苷酸引物。當用于和靶序列雜交的寡核苷酸引物位于距mRNA 5′端150 bp以內時，可獲得最佳結果。在更遠距離處雜交的引物能增加異源延伸產物，因為反轉錄酶會在模板RNA的二級結構復雜區終止。因此，在設計引物時，除實際的序列之外還應考慮到雜交的位置。應盡可能使寡核苷酸的GC含量在50%左右且在3′端為G或C。用兩個引物在mRNA相距一段已知距離（20~50 bp）的區域上分別雜交則更為理想。大小差別等于兩個引物間距的延伸產物，可對結果進行驗證。為了找到一對能產生明確延伸產物的引物，合成多個引物也許是必須的。
在很多情況下，引物延伸反應會產生兩個產物：全長cDNA分子和短2~2 bp的反轉錄產物。這可能代表著多個轉錄起始位點導致的mRNA 5′端不均一性。有時，在臨近靶mRNA 加帽位點的甲基化殘基處的提前終止將產生更短的產物。與帽子結構相關的條帶在不同mRNA 樣品中的化學定量是不同的，對于一份給定樣品總是一個定值。為了區分反轉錄假象和真正的mRNA 5′端不均一性，用5′端標記的探針進行S1核酸酶分析是一個很好的方法。
與未進一步分離的哺乳動物RNA相比，poly（A）+RNA樣品可得到干凈得多的結果，因為前者分產生多到不可接受的提前終止產物。通過在更高濃度（5 mmol/l）dNTP下進行延伸反應，并在用互補區位于mRNA 5′端50~100 bp以內的引物可將假象降至最低。
用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化寡核苷酸引物一度是必須的。介這些年來，除非總是產生延伸產物的梯狀條帶，許多研究者已不再費心純化了。
在雜交反應中，核苷酸引物分子的量應大約10倍于靶mRNA。更多量的引物可能會導致非特異延伸和人為條帶的出現。所以，且一定量RNA與不同量的引物（通常為20~40 fmol，104~105 cpm）進行一系列預實驗是可取的。
復性溫度極大地影響引物延伸實驗的質量，值得在預實驗中調查以確定最佳復性溫度。多數情況下，對于GC含量為50%，20~30 bp的引物，其最佳復性溫度在40~60℃之間。可以設置一系列以5℃為間隔的引物延伸反應來確定最佳復性溫度。
當用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析延伸產物時，大小已知、末端標記的DNA片段可用作相對分子質量標記參照物。但最好是采用與延伸反應相同引物的基于DNA模板的測序圖，通過對照測序圖讀出引物延伸反應產物的大小，靶RNA的5′端可定位于一個特定的堿基。