生化實驗講義(理論部分)四－－電泳技術（一）

4.1 電泳技術發展簡史

1809年俄國物理學家Рейсе首次發現電泳現象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負兩個電極，加電壓后發現正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現象。

1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。

1937年瑞典Uppsala大學的Tiselius對電泳儀器作了改進，創造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術方面作出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學獎。

1948年Wieland和Fischer重新發展了以濾紙作為支持介質的電泳方法，對氨基酸的分離進行過研究。

從本世紀50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質的分離以后，開創了利用各種固體物質(如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等)作為支持介質的區帶電泳方法。

1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質，創建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術的分辨率，開創了近代電泳的新時代。30多年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學和分子生物學中對蛋白質、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術，是檢驗生化物質的最高純度：即“電泳純”(一維電泳一條帶或二維電泳一個點)的標準分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對生物大分子進行分析鑒定的最后、最準確的手段，即“Last Check”。

由80年代發展起來的新的毛細管電泳技術，是化學和生化分析鑒定技術的重要新發展，己受到人們的充分重視。

4.2 電泳的基本原理

電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。

電泳過程必須在一種支持介質中進行。Tiselius等在1937年進行的自由界面電泳沒有固定支持介質，所以擴散和對流都比較強，影響分離效果。于是出現了固定支持介質的電泳，樣品在固定的介質中進行電泳過程，減少了擴散和對流等干擾作用。最初的支持介質是濾紙和醋酸纖維素膜，目前這些介質在實驗室已經應用得較少。在很長一段時間里，小分子物質如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質的電泳進行分離、分析，但目前則一般使用更靈敏的技術如HPLC等來進行分析。這些介質適合于分離小分子物質，操作簡單、方便。但對于復雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質的引入大大促進了電泳技術的發展，使電泳技術成為分析蛋白質、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。

電泳裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產生電場，驅動帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開，在玻璃平板中間制備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm ? 14 cm，厚度為1mm～2 mm，近年來新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節省試劑和縮短電泳時間。制膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子，在膠聚合后移去，形成上樣品的凹槽。水平式電泳，凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液，或將凝膠直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變，進而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過程應在適當的緩沖液中進行的，緩沖液可以保持待分離物的帶電性質的穩定。

為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的，下面簡單介紹一下電泳的基本原理。在兩個平行電極上加一定的電壓(V)，就會在電極中間產生電場強度(E)，L是電極間距離。

在稀溶液中，電場對帶電分子的作用力(F)，等于所帶凈電荷與電場強度的乘積。

這個作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，分子會受到介質粘滯力的阻礙。粘滯力(F’)的大小與分子大小、形狀、電泳介質孔徑大小以及緩沖液粘度等有關，并與帶電分子的移動速度成正比，對于球狀分子，F’的大小服從Stokes定律，即：

F’=6πrηυ

式中r是球狀分子的半徑，η是緩沖液粘度，υ是電泳速度(υ= d / t，單位時間粒子運動的距離，cm / s )。當帶電分子勻速移動時： F = F’，

∴ q?E = 6πrηυ

由此可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。

用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量時，實際使用的是相對遷移率mR。

帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區帶而被分開。即使兩個分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進行分離，如等電聚焦電泳;而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產生的阻力不同而得到分離，如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標記，則可以通過放射性自顯影等方法進行檢測。

4.3 影晌電泳分離的主要因素

由電泳遷移率的公式可以看出，影響電泳分離的因素很多，下面簡單討論一些主要的影響因素：

1. 待分離生物大分子的性質

待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質都會對電泳有明顯影響。一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。

2. 緩沖液的性質

緩沖液的pH值會影響待分離生物大分子的解離程度，從而對其帶電性質產生影響，溶液pH值距離其等電點愈遠，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對于蛋白質等兩性分子，緩沖液pH還會影響到其電泳方向，當緩沖液pH大于蛋白質分子的等電點，蛋白質分子帶負電荷，其電泳的方向是指向正極。為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液pH值的穩定性，緩沖液通常要保持一定的離子強度，一般在0.02-0.2，離子強度過低，則緩沖能力差，但如果離子強度過高，會在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層(即離子氛)，由于離子氛與待分離分子的移動方向相反，它們之間產生了靜電引力，因而引起電泳速度降低。另外緩沖液的粘度也會對電泳速度產生影響。

3. 電場強度

電場強度(V/cm)是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強度越大，電泳速度越快。但增大電場強度會引起通過介質的電流強度增大，而造成電泳過程產生的熱量增大。電流在介質中所做的功(W)為：

W=I2.R.t

上式中：I為電流強度，R為電阻，t為電泳時間。

電流所作的功絕大部分都轉換為熱，因而引起介質溫度升高，這會造成很多影響：

①樣品和緩沖離子擴散速度增加，引起樣品分離帶的加寬;②產生對流，引起待分離物的混合;③如果樣品對熱敏感，會引起蛋白變性;④引起介質粘度降低、電阻下降等等。電泳中產生的熱通常是由中心向外周散發的，所以介質中心溫度一般要高于外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質相對于外周部分粘度下降，摩擦系數減小，電泳遷移速度增大，由于中央部分的電泳速度比邊緣快，所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強度，可以減小生熱，但會延長電泳時間，引起待分離生物大分子擴散的增加而影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當的電場強度，同時可以適當冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。

4. 電滲

液體在電場中，對于固體支持介質的相對移動，稱為電滲現象。由于支持介質表面可能會存在一些帶電基團，如濾紙表面通常有一些羧基，瓊脂可能會含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基團等等。這些基團電離后會使支持介質表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子，在電場的作用下向電極方向移動，形成介質表面溶液的流動，這種現象就是電滲。在pH值高于3時，玻璃表面帶負電，吸附溶液中的正電離子，引起玻璃表面附近溶液層帶正電，在電場的作用下，向負極遷移，帶動電極液產生向負極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同，則加快電泳速度;如果相反，則降低電泳速度。

5. 支持介質的篩孔

支持介質的篩孔大小對待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質中泳動速度快，反之，則泳動速度慢。

4.4 電泳的分類

⑴ 區帶電泳：電泳過程中，待分離的各組分分子在支持介質中被分離成許多條明顯的區帶，這是當前應用最為廣泛的電泳技術。

⑵ 自由界面電泳： 這是瑞典Uppsala大學的著名科學家Tiselius最早建立的電泳技術，是在U形管中進行電泳，無支持介質，因而分離效果差，現已被其他電泳技術所取代。

⑶ 等速電泳：需使用專用電泳儀，當電泳達到平衡后，各電泳區帶相隨，分成清晰的界面，并以等速向前運動。

⑷ 等電聚焦電泳：由兩性電解質在電場中自動形成pH梯度，當被分離的生物大分子移動到各自等電點的pH處聚集成很窄的區帶。

按支持介質的不同可分為：

⑴ 紙電泳(Paper electrophorisis)

⑵ 醋酸纖維薄膜電泳(Cellulose Acetate electrophoresis)

⑶ 瓊脂凝膠電泳(Agar Gel electrophoresis)

⑷ 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE)

⑸ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

按支持介質形狀不同可它為：

⑴ 薄層電泳 ; ⑵ 板電泳 ; ⑶ 柱電泳。

按用途不同可分為：

⑴ 分析電泳; ⑵ 制備電泳; ⑶ 定量免疫電泳; ⑷ 連續制備電泳。

按所用電壓不同可分為：

⑴ 低壓電泳：100V～500V，電泳時間較長，適于分離蛋白質等生物大分子。

⑵ 高壓電泳：1000V～5000V，電泳時間短，有時只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質的分離。

4.5 紙電泳和醋酸纖維薄膜電泳

紙電泳是用濾紙作支持介質的一種早期電泳技術。盡管分辨率比凝膠介質要差，但由于其操作簡單，所以仍有很多應用，特別是在血清樣品的臨床檢測和病毒分析等方面有重要用途。

紙電泳使用水平電泳槽。分離氨基酸和核苷酸時常用pH 2～3.5的酸性緩沖液，分離蛋白質時常用堿性緩沖液。選用的濾紙必須厚度均勻，常用國產新華濾紙和進口的Whatman 1號濾紙。點樣位置是在濾紙的一端距紙邊5cm～10cm處。樣品可點成園形或長條形，長條形的分離效果較好。點樣量為5?g～100?g和5?l～10?l。點樣方法有干點法和濕點法。濕點法是在點樣前即將濾紙用緩沖液浸濕，樣品液要求較濃，不亦多次點樣。干點法是在點樣后再用緩沖液和噴霧器將濾紙噴濕，點樣時可用吹風機吹干后多次點樣，因而可以用較稀的樣品。電泳時要選擇好正、負極，電壓通常使用2～10 V/cm的低壓電泳，電泳時間較長。對于氨基酸和肽類等小分子物質，則要使用50～200 V/cm的高壓電泳，電泳時間可以大大縮短，但必須解決電泳時的冷卻問題，并要注意安全。

電泳完畢記下濾紙的有效使用長度，然后烘干，用顯色劑顯色，顯色劑和顯色方法，可查閱有關書藉。定量測定的方法有洗脫法和光密度法。洗脫法是將確定的樣品區帶剪下，用適當的洗脫劑洗脫后進行比色或分光光度測定。光密度法是將染色后的干濾紙用光密度計直接定量測定各樣品電泳區帶的含量。

醋酸纖維薄膜電泳與紙電泳相似，只是換用了醋酸纖維薄膜作為支持介質。將纖維素的羥基乙酰化為醋酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一細密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm。

醋酸纖維薄膜電泳與紙電泳相比有以下優點：① 醋酸纖維薄膜對蛋白質樣品吸附極少，無“拖尾”現象，染色后蛋白質區帶更清晰。② 快速省時。由于醋酸纖維薄膜親水性比濾紙小，吸水少，電滲作用小，電泳時大部分電流由樣品傳導，所以分離速度快，電泳時間短，完成全部電泳操作只需90 min左右。③ 靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需 2?l 血清，點樣量甚至少到0. 1?l，僅含5?g的蛋白樣品也可以得到清晰的電泳區帶。臨床醫學用于檢測微量異常蛋白的改變。④ 應用面廣。可用于那些紙電泳不易分離的樣品，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等。⑤ 醋酸纖維薄膜電泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度計和分光光度計掃描定量及長期保存。

由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡單、快速、價廉，目前已廣泛用于分析檢測血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸及其他生物大分子，為心血管疾病、肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據，因而已成為醫學和臨床檢驗的常規技術。

4.6 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D-半乳糖和3,6脫水L-半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1%-3%，加熱煮沸至溶液變為澄清，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖之間以分子內和分子間氫鍵形成較為穩定的交聯結構，這種交聯的結構使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過程中發生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。市售的瓊脂糖有不同的提純等級，主要以硫酸根的含量為指標，硫酸根的含量越少，提純等級越高。

瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質和核酸的電泳支持介質，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質來說是比較大的，對蛋白質的阻礙作用較小，這時蛋白質分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質大小而只根據蛋白質天然電荷來進行分離的電泳技術，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，這時分子的大小會對電泳遷移率產生明顯影響。例如對于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關，而與堿基排列及組成無關。另外，一些低熔點的瓊脂糖(62 ~ 65 ?C)可以在65 ?C時熔化，因此其中的樣品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。

由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應用得相對較少。

4.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉雙丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學聚合和光聚合。化學聚合通常是加入催化劑過硫酸銨(AP)以及加速劑四甲基乙二胺(TEMED)，四甲基乙二胺催化過硫酸銨產生自由基。

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3%-30%之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3%的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA;高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的作用，可以用于根據蛋白質的分子量進行分離的電泳中，如10%-20%的凝膠常用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。

選擇T和C的經驗公式是：

C = 6.5-0.3T

此式可用于計算T為5%～20%時的凝膠組成。C值并不很嚴格，在大多數情況下，可變化的范圍約為 ?1%，當C保持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當T保持恒定，C為4%時，有效孔徑最小，C大于或小于4%時，有效孔徑均變大，C大于5%時凝膠變脆，不宜使用，實驗中最常用的C是2.6%和3%。

配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個月，在貯存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而增加電泳時的電內滲現象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經系統有毒的試劑，操作時要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無毒。

未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對某個特定的生物大分子進行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。

由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優點，因而四十年來得到廣泛的應用，目前尚無更好的支持介質能夠取代它。其主要的優點有：①可以隨意控制膠濃度“T”和交聯度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應結合在同一方法中，達到更高的靈敏度：10-9 ～10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝膠是由-C-C-鍵結合的酰胺多聚物，側鏈只有不活潑的酰胺基-CO-NH2 ，沒有帶電的其他離子基團，化學惰性好，電泳時不會產生“電滲”。④由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復性好。⑤透明度好，便于照相和復印。機械強度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。⑥無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。

聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質最初是在玻璃管中進行的，玻璃管通常直徑為7 mm，長10 cm，將凝膠裝入到多個管中進行電泳，又稱為柱狀電泳。目前仍有應用，尤其用于二維電泳中的第一維電泳。但由于各個玻璃管的不同以及裝膠時的差異使每管的分離條件會有所差異，所以對各管樣品進行比較時可能會出現較大誤差。后來發展起來的垂直平板電泳一次最多可以容納20個樣品，電泳過程中樣品所處的條件比較一致，樣品間可以進行更好的比較，重復性也更好，所以垂直平板電泳目前應用的更為廣泛，常用于蛋白質及DNA序列分析過程中DNA片段的分離、鑒定。

水平平板電泳近年來也有很快的發展，與垂直平板電泳相比也有其獨特的優點：①由于凝膠可以直接鋪在冷卻板上，容易使凝膠冷卻，因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快，通常只要1小時左右，而園盤電泳和垂直平板電泳一般需要3～4小時。③因為可以使用薄膠，加樣少，染色快，從而提高了靈敏度，而且容易保存，只要用甘油浸泡后自然干燥即可長期保存不會龜裂。④便于適用各種電泳方式，用途廣泛，尤其是可以使用90年代才發展起來的只有水平電泳系統才能使用的新的半干技術，即用浸有少量緩沖液的半干的膠條代替通常所用的大量電極緩沖液，大大節約了試劑，簡化了操作，提高了電泳速度。

聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯百分濃度。

4.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質的電泳方法，特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量。

SDS-PAGE 是在要走電泳的樣品中加入含有SDS和?-巰基乙醇的樣品處理液，SDS即十二烷基磺酸鈉(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+)，是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構，強還原劑?-巰基乙醇可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質的四級結構。電泳樣品加入樣品處理液后，要在沸水浴中煮3～5 min，使SDS與蛋白質充分結合，以使蛋白質完全變性和解聚，并形成棒狀結構。SDS與蛋白質結合后使蛋白質-SDS復合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子，這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質本身電荷上的差異。樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，用于控制電泳過程。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。

制備凝膠時首先要根據待分離樣品的情況選擇適當的分離膠濃度，例如通常使用的15%的聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍是104～105，即分子量小于104的蛋白質可以不受孔徑的阻礙而通過凝膠，而分子量大于105的蛋白質則難以通過凝膠孔徑，這兩種情況的蛋白質都不能得到分離。所以如果要分離較大的蛋白質，需要使用低濃度如10%或7.5%的凝膠(孔徑較大);而對于分離較小的蛋白質，使用的較高濃度凝膠(孔徑較小)可以得到更好的分離效果。分離膠聚合后，通常在上面加上一層濃縮膠(約1 cm)，并在濃縮上插入樣品梳，形成上樣凹槽。濃縮膠是低濃度的聚丙烯酰胺凝膠，由于濃縮膠具有較大的孔徑(丙烯酰胺濃度通常為3～5%)，各種蛋白質都可以不受凝膠孔徑阻礙而自由通過。濃縮膠通常pH值較低(通常pH = 6.8)，用于樣品進入分離膠前將樣品濃縮成很窄的區帶。濃縮膠聚合后取出樣品梳，上樣后即可通電開始電泳。

聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統，即只有分離膠的連續系統和有濃縮膠與分離膠的不連續系統，不連續系統中最典型、國內外均廣泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH堿性不連續系統，其濃縮膠丙烯酰胺濃度為4%，pH = 6.8，分離膠的丙烯酰胺濃度為12.5%，pH = 8.8。電極緩沖液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配膠的緩沖液用Tris、SDS和HCl配制。

樣品在電泳過程中首先通過濃縮膠，在進入分離膠前由于等速電泳現象而被濃縮。這是由于在電泳緩沖液中主要存在三種陰離子，Cl-、甘氨酸陰離子以及蛋白質-SDS復合物，在濃縮膠的pH值下，甘氨酸只有少量的電離，所以其電泳遷移率最小，而Cl-的電泳遷移率最大。在電場的作用下，Cl-最初的遷移速度最快，這樣在Cl-后面形成低離子濃度區域，即低電導區，而低電導區會產生較高的電場強度，因此Cl-后面的離子在較高的電場強度作用下會加速移動。達到穩定狀態后，Cl-和甘氨酸之間形成穩定移動的界面。而蛋白質-SDS復合物由于相對量較少，聚集在甘氨酸和Cl-的界面附近而被濃縮成很窄的區帶(可以被濃縮三百倍)，所以在濃縮膠中Cl-是快離子(前導離子)，甘氨酸是慢離子(尾隨離子)。

當甘氨酸到達分離膠后，由于分離膠的pH值(通常pH = 8.8)較大，甘氨酸離解度加大，電泳遷移速度變大超過蛋白質-SDS復合物，甘氨酸和Cl-的界面很快超過蛋白質-SDS復合物。這時蛋白質-SDS復合物在分離膠中以本身的電泳遷移速度進行電泳，向正極移動。由于蛋白質-SDS復合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快;大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。溴酚藍指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置。當指示劑到達凝膠底部時，停止電泳，從平板中取出凝膠。在適當的染色液中(如通常使用的考馬斯亮藍)染色幾個小時，而后過夜脫色。脫色液去除凝膠中未與蛋白結合的背底染料，這時就可以清晰地觀察到凝膠中被染色的蛋白質區帶。通常凝膠制備需要1～1.5小時，電泳在25～30mA下通常需要3小時，染色2～3小時，過夜脫色。通常使用的垂直平板電泳可以同時進行多個樣品的電泳。

Ornstein和Davis設計的高pH堿性不連續系統，有其獨特的特點：① 濃縮膠的pH(6.8)小于慢離子甘氨酸的pKa(9.8)3個pH左右，所以 α≈ 0.001，即在濃縮膠中甘氨酸只有0.1%離解，因此在電場中遷移很慢，是慢離子。② 快離子Cl-由于幾乎全部離解，電泳遷移率最大，不受pH變化的影響。③ 分離膠的pH(8.8)小于慢離子的pKa 一個pH左右，α≈ 0.1，所以在分離膠中甘氨酸離解加大，電泳遷移率加大，就趕到蛋白質帶的前面。

此外還可以總結出該系統的特點有：④ 電極緩沖液中共軛堿Tris的pKa小于分離膠的pH約1個pH，使其緩沖能力大。⑤電極緩沖液的pH為8.3，相近于Tris的pKa(8.1)，以便獲得最大的緩沖能力。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測定，在同一凝膠上對一系列已知分子量的標準蛋白及未知蛋白進行電泳，測定各個的標準蛋白的電泳距離(或遷移率)，并對各自分子量的對數(log Mr)作圖，即得到標準曲線。測定未知蛋白質的電泳距離(或遷移率)，通過標準曲線就可以求出未知蛋白的分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳經常應用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。