NatRevGenetics|環狀RNA的合成與功能

　　環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種新興的內源性非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)，是繼microRNA (miRNA)以及long noncoding RNA (IncRNA)后非編碼RNA家族中極具研究潛力的新成員。越來越多的研究表明，環狀RNA具有種類豐富、結構穩定、序列保守以及細胞或組織特異性表達等特點。近年來，隨著RNA研究技術的進步，研究者們在多種生物中發現了數量眾多的環狀RNA，且發現它們具有重要的生物學功能，例如作為天然小RNA(miRNA)海綿體吸附并調控miRNA的活性，與轉錄調控元件結合或與蛋白互作調控基因的轉錄等。已有研究表明，環狀RNA與糖尿病、神經系統疾病、心血管疾病和癌癥等疾病有關，因此具有重要的研究價值。此外，環狀RNA的廣泛表達和疾病調控機制使其成為多種疾病的功能生物標志物和治療靶點。

　　近日，丹麥奧胡斯大學分子生物學和遺傳學(MBG)系Lasse Kristensen等研究人員在Nature Revies Genetics雜志上發表題為The biogenesis, biology andcharacterization of circular RNAs綜述。在這篇綜述中，作者首先介紹了環狀RNA的生物發生及特征，隨后介紹了環狀RNA的鑒定方法，并對環狀RNA涉及的生物學功能以及目前確定其功能的研究方法進行了詳細總結。

　　對環狀RNA認識觀念的轉變

　　1976 年，當Sanger首先在植物類病毒中發現了共價閉合的環狀RNA，以及1979年Hsu 通過電鏡在HeLa細胞細胞質發現了類似的環狀轉錄本時，人們一度認為環狀 RNA只是錯誤剪接的產物，也就是垃圾DNA。直至1993年，Capel發現小鼠Sry (sex-determining region Y)基因的環狀RNA可能在小鼠睪丸發揮特定功能，環狀RNA才真正進入科學研究領域的視野，并逐漸成為研究的焦點。特別是近年來，隨著高通量測序和生物信息學分析技術的發展，環狀RNA的研究已經上升到了一個新的高點。

　　環狀RNA的一般常識

　　通常來說，大多數環狀RNA是由已知的蛋白基因編碼，且由一個或者數個外顯子組成。環狀RNA主要是通過頭對尾的反向剪接方式產生，但是在環狀RNA上也會發現線性RNA選擇性剪切的一些基本特征，然而一些環狀RNA還會包含一些不會出現在線性RNA上的外顯子序列。由于其不含有帽子結構和polyA尾巴，環狀RNA主要定位于細胞質中。但是一些不同來源的環狀RNA，比如外顯子?內含子環狀 RNA (exon-intron circRNA, EIciRNA)和僅內含子來源的環狀 RNA (circular intronic RNA, ciRNA)則會定位于細胞核。可能是由于它們獨特的環狀結構，環狀RNA比線性RNA更穩定，這也是導致其耐核酸外切酶的降解機制，并最終可以實現環狀RNA在某些特定的細胞中累積。一般而言，環狀RNA表達水平較低，有趣的是，在神經發生過程中有很多環狀RNA上調，一些環狀RNA在突觸中富集。相比之下，環狀RNA在癌癥及一些其他疾病中則會出現下調。有可能是因為受這些疾病中的細胞增殖速率較快的影響，環狀RNA尚未達到穩定水平。到目前為止，環狀RNA被證明與多種人類疾病有關，包括糖尿病、神經系統疾病、心血管疾病、慢性炎癥和癌癥。此外，還發現環狀RNA在衰老的過程中會不斷累積。

一 環狀RNA的生物發生及特征

　　環狀RNA的生物發生

　　環狀RNA主要由前體RNA（pre-mRNA）通過可變剪切加工產生。盡管反剪接被認為是一種選擇性剪接，但它與線性選擇性剪接具有不同的分子機理。目前有關環狀RNA的生物合成機制仍然未全面闡明。

　　環狀RNA的發生不僅依賴于經典的剪接性位點，同時還依賴于經典的剪接性機制。反向剪接的剪接信號和剪接體與經典的RNA剪接的類似，反向剪接與經典的RNA剪接具有一定的競爭關系（圖1）。當pre-mRNA處理事件減慢時，新生的RNA可以被導向另一種途徑以促進反剪接。比如，對果蠅細胞的研究表明，通過減少U2 snRNP抑制剪接體可顯著增加環狀RNA與線性RNA的比值。此外，另外一項研究也表明消耗剪接因子可以增加環狀RNA的水平。當多個因子被耗盡時，可以觀察到加性效應，因此每個剪接因子在環狀RNA的形成過程中均發揮一定作用。

　　反向剪接的假說主要是下游剪接位點反向與上游剪接位點連接形成的閉合環狀RNA分子。這主要通過反向重復元件（例如Alu元件）之間的堿基對、RBPs的二聚或RBPs與側翼內含子中的特定基序結合使下游剪接給體位點(SD)與上游剪接受體位點(SA)接近（圖1 a），也就是通常所說的內含子配對驅動環化和RNA 結合蛋白驅動環化。其次，外顯子跳讀所形成的套索驅動環化也是環狀RNA生成的一種機制。此外，剪接過程中從分支結構脫離的內含子索套也會產生環狀RNA（圖1 b）。

　　目前研究發現環狀RNA的形成是受多個因素調控的，是受包括異質性核糖核酸蛋白(hnRNPs)和SR蛋白(即含有長重復絲氨酸和精氨酸氨基酸殘基的蛋白)在內的順式作用元件和反式剪接因子的聯合作用。還有一些蛋白或分子會參與環狀RNA的調控，比如，ADAR（防止先天免疫系統激活功能的雙鏈RNA (dsRNA)特異性腺苷脫氨酶）通過與雙鏈 RNA 相結合將腺嘌呤核苷編輯為次黃嘌呤核苷，以及依賴ATP的RNA解旋酶A(也稱為DHX9)通過反向重復之間堿基配對抑制環狀RNA的生物發生。也有一些蛋白或分子可以促進環狀RNA的和形成，例如，長側翼內含子、反向重復元件(如Alu元件)和反式RNA結合蛋白（RBPs；例如RNA結合蛋白FUS、震動蛋白 (HQK)、NF90和NF110，這些均是白細胞介素增強子結合因子3基因的蛋白產物，它們都有助于反向剪接。此外，組蛋白和基因體的表觀遺傳變化會影響選擇性剪接，也可能會造成對環狀RNA的生物發生的直接影響。比如近期的一項研究就表明DNMT3B作為DNA甲基化維持所必需的關鍵甲基轉移酶，對其敲減以后發現環狀RNA表達的變化，而這些變化與相應的線性宿主基因表達的變化無關。

　　環狀RNA的特征

　　關于環狀RNA的特征，本文從環狀RNA的亞細胞定位和穩定性兩方面進行了綜述。

　　環狀RNA的亞細胞定位

　　正如前文所述，絕大多數環狀RNA在細胞質中富集，少數定位于細胞核內。環狀RNA是通過ATP依賴性RNA解旋酶DDX39A（也稱為RNA解旋酶URH49或URH49）和剪接體RNA解旋酶DDX39B（也稱為DEAD盒蛋白UAP56或UAP56）從細胞核轉運至細胞質的。在人類細胞中，UAP56負責轉運較長的circRNA（> 1,200個核苷酸）而URH49轉運較短的circRNAs（<400個核苷酸）；然而，將環狀RNA從細胞核到細胞質，不同的物種可能對于環狀RNA長度的要求可能是不同的。

　　環狀RNA的穩定性

　　RNA呈閉合環狀結構，不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更加穩定。目前對于其的降解機制仍知之甚少，初始數據表明含有m6A的環狀RNA可被核糖核酸酶P復合體以一種依賴于含有YTH結構域的家族蛋白2 (YTHDF2)和熱敏蛋白質12 (HRSP12)的方式降解，并且在病毒感染時，環狀RNA幾乎全部經RNase L降解。此外，miR-671可能與CDR1AS結合促進AGO2裂解環狀RNA，同時，miR-7還可通過招募miR-671促進對環狀RNA 的降解，盡管目前對于其可能的相關機制并不是十分清晰。對人類細胞的研究表明還可能通過將環狀RNA以活性物質輸出也是一種清除機制。以一些近期研究為例，研究人員發現ciRS-7和circHIPK3在胞外囊泡的含量較高，但目前還不清楚這是否會顯著降低細胞水平上環狀RNA的含量。更加有趣的是，小型環狀RNA被積極地經囊泡介導的輸出，例如ciRS-7可以在細胞外囊泡中保留其環狀性質，并在受體細胞中釋放后發揮作用，這表明，環狀RNA的輸出可能對細胞間通訊是很重要的。

圖1. 環狀RNA的發生

二 發現及鑒定環狀RNA的技術

　　目前，對于環狀RNA的經典研究策略主要是通過對去除核糖體，如RNARibo-Zero技術捕獲captures rRNA進行全基因組環狀RNA分析。但是基因組以及位點特異性環狀RNA分析技術也存在一定的缺陷，這類方法只能識別環狀RNA上特異的反向連接區域（BSJ），但不能檢測到內部剪切模式。同時，大多數檢測環狀RNA的方法均會涉及逆轉錄以及PCR擴增，這些均會導致一定的錯誤或偏倚發生。此外，有些時候還需要通過RNA酶R處理線性RNA，但是某些線性RNA由于其二級結構可能會對RNA酶R耐受。本綜述就近期一些新的研究方法就行分析討論。

　　環狀RNA全基因組分析

　　測序 用去核糖體RNAs (rRNAs)和使用隨機引物的RNA-seq，是早期鑒定circRNA的主流方法。該方法的優點是可以同時獲得非編碼和編碼RNA的表達信息，但該方法需要深度測序才能獲得足夠的信息。因此，我們建議至少進行100 bp測序，以獲得足夠的讀長，從而能夠基于BSJs跨讀區對環狀RNA進行準確的預測。

　　生物信息學 在生物信息計算方面，目前已經開發了多種算法對環狀RNA進行預測。CIRI2算法目前被認為是最好的獨立算法，但是研究發現單個軟件往往因為算法的設計問題在某些方面存在著一定的局限性，建議同時使用2個及以上的軟件進行環狀 RNA 的預測。

　　基因芯片 另外，包含有反向剪接探針的芯片技術也可以作為RNA-seq技術的一種替換手段。第一個商業化的環狀RNA芯片來自于 Arraystar公司。其circRNA來源融合了環狀RNA研究的最新頂尖文獻，所有cicrRNA都經過了嚴謹的實驗驗證，以便于對不同生理及病理條件下的circRNA進行系統的研究。

　　環狀RNA位點特異性分析

　　依賴于對BSJs基因組位置的環狀RNA的位點特異性檢測，可用于驗證全基因組實驗的數據，或研究以前環狀RNA的特征。許多常用的分子生物學技術已被應用于環狀RNA的檢測，然而，每種技術在這一領域都有各自的優缺點。以作為驗證環狀RNA的金標準Northern blotting為例，該方法不需要反轉和擴增步驟，并可對探針進行個性化設計。但是卻需要大量RNA，而且耗時耗力，且需使用放射性標記探針。因此，人們更傾向使用覆蓋BSJ的不同引物的RT-PCR檢測環狀RNA。如果需要對環狀RNA進行定量分析，一般也采用定量PCR (RT-qPCR)。但目前尚無商化的RT-qPCR檢測和定量試劑，因此，可能需要精心設計、優化和驗證這些方法。在RT過程中通過滾動擴增形成的串聯體，可能會影響RT-qPCR對環狀RNA的準確定量。而最近出現的數字PCR或許可以避免這一問題，并且對一些難度較大的樣本，例如血漿，可能更具有優勢。Nature子刊Laboratory Investigation在線發布了一項circRNA的定量分析技術，基于NanoString nCounter 熒光條形碼標記檢測技術實現circRNA絕對定量分析，該技術靈敏度較高，穩定性好，而且具有一定的通量。NanoString nCounter技術使用的兩種探針長度在35-50nt，設備經條件優化后一次性可檢測800個分子。該技術中的捕獲探針帶生物素標記，報告探針帶四色熒光基團，可通過不同的排列組合方式實現標記。檢測過程中將總RNA與兩種探針雜交，純化，固定后掃描后得到表達量的結果。該技術可實現從福爾馬林固定石蠟包埋樣品中提取RNA的定量，因此有望成為circRNA檢測的新金標準。

　　環狀RNA的可視化

　　由于環狀RNA的亞細胞位置上呈多樣化，此外，某些circRNA具有獨特的亞細胞位置，有可能是全新的亞細胞構成。因此，原位雜交技術（ISH）被廣泛運用于對環狀RNA的檢測及定位。一般來說，ISH探針要跨越BSJ，以便清楚地識別circRNA在哪些組織中表達很高，作為組織特性判斷的依據。此外，為優化ISH技術，還可以對多固定的樣本進行蛋白酶K和RNA酶R預處理。小干擾RNA (siRNA)介導的circRNA或mRNA對照樣品的敲除可用于測試樣品中的非特異性結合的估算。BaseScope技術及試劑盒利用了改進的探針ZL技術可產生更強信號的同時亦可抑制背景噪音，并以單分子檢測靈敏度檢測某個特定RNA位點。另一種對特定環狀RNA成像和跟蹤的方法利用了用一種催化死亡的Cas13a(以前稱為C2c2)與熒光蛋白（如增效綠色熒光蛋白）(EGFP))結合的技術，該方法類似于CRISPR Cas9在基因組工程中的應用，死亡Cas13a對目標RNA88保持著很高的親和力，因此可以作為一種基于導向RNA的可編程RBP，但是該方法也存在一定的局限性。

三 環狀RNA的功能

　　大量的研究表明circRNA在生物的生長發育、脅迫應答、疾病發生和發展等方面密切相關，并預測其在疾病診斷標記物等方面的應用前景，但其生物學功能在很大程度上仍然未知。目前認可度比較高的circRNA生物學功能主要包括環狀RNA作為miRNA sponge、單個環狀RNA調控蛋白結合、環狀RNA與蛋白質相互作用的協同作用及編碼功能，本文就以上幾方面對環狀RNA的功能做一介紹。

　　單個環狀RNA作為miRNA sponge

　　近年的研究表明，環狀RNA分子富含microRNA（miRNA）結合位點，在細胞中起到miRNA海綿（miRNA sponge）的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，這一作用機制被稱為競爭性內源RNA（ceRNA）機制（圖2a）。研究表明，含有許多競爭性結合位點的高度豐富的環狀RNA更有可能具有競爭性的內源性RNA功能，比如在許多組織中，特別是在大腦中，都有高度穩定的表達的ciRS-7含有超過70個miR-7的結合位點，通過AGO2 蛋白實現競爭性吸附miR-7進而調控靶基因。研究發現ciRS-7敲除小鼠中miR-7水平顯著地下降，但是其它一些研究發現ciRS-7表達與miR-7表達呈負相關。有趣的是，在ciRS-7敲除小鼠中包括miR-7靶基因Fos在內的早期基因會出現上調，而ciRS-7敲除小鼠表現出與神經精神疾病相關的行為表型。值得注意的是，盡管有些環狀RNA有miRNA sponge的特征，但是它們所含有的結合位點卻比預期較低。

　　環狀RNA還有可能在細胞分化過程中誘導產生，比如circZNF91，它和ciRS-7一樣具有多個與miRNA的結合位點（circZNF91包含與miR-23b-3p結合的24個結合位點）。但是一些腫瘤領域的研究顯示，單個環狀RNA可能具有與多個miRNA的結合位點，而不是僅包含與一個特定miRNA結合的多個位點。有一種假說認為，分化細胞中較高水平的環狀RNA可能與大量的miRNA進行協同作用，但這一假說尚未得到實驗驗證。

圖 2環狀RNA作為miRNA或蛋白海綿

　　單個環狀RNA作為蛋白sponge調控蛋白結合

　　有些環狀RNA上有一個或者多個RNA結合蛋白的結合位點，可作為蛋白分子的海綿體（圖2b）。第一個例子來自于對黑腹黑腹果蠅中編碼mbl的剪接因子蛋白基因的研究。MBL能促進circMbl的合成，且合成的circMbl上存在特異性的MBL結合位點。當MBL高表達時，會促進circMbl的生成而抑制了線性轉錄本的表達；并且circMbl會與過量的MBL結合，使其含量趨于穩定。因此，可能存在一種自調節回路，其中過量的mbl或MBNL1通過促進環狀RNA的生物發生而降低自身mRNA的產生，環狀RNA通過與mbl或MBNL1的連接促進基因的線性剪接。

　　還有一些環狀RNA能夠與蛋白相互作用抑制翻譯進程，如circPABPN1通過在人宮頸癌HeLa細胞s93中與RBP hu抗原R (HUR)隔離，抑制核多聚(A)結合蛋白1 (PABPN1) mRNA的翻譯；circANRIL通過與pescadillo同源物1 (PES1)結合，抑制rRNA前處理和核糖體生物發生。另外一項研究表明環狀RNA能夠與核cGAS結合阻止它與自身DNA結合。還有一些環狀RNA，如circ-Amotl1和circFOXO3可以作為作為蛋白質支架，促進酶及其底物的共域化。CircFoxo3上同時存在 MDM2 (mouse double-minute 2)和 p53的結合位點，circFoxo3 能促使MDM2誘導的p53的泛素化，導致p53蛋白的整體降解。最后，環狀RNA可能會將特定的蛋白質招募到特定的細胞位置，例如來源于FLI1基因的環狀 RNA(FECR1)，能特異性地與FLI1啟動子區域結合，并招募去甲基酶TET1誘導該區域的去甲基化。

　　環狀RNA與蛋白質相互作用的協同作用

　　細胞質中多個環狀RNA與特定蛋白的協同結合可能形成一個蛋白質分子庫，對細胞外刺激做出快速反應。這樣可用于在病毒感染時使免疫反應迅速，以NF90/NF110為例，它在細胞質中更容易與環狀RNA分子結合，由于環狀RNA分子穩定的特性進而導致NF90/NF110在分子水平的累計。與此類似的還有不少內源性的環狀RNA在抗病毒反應中發揮作用。有的circRNAs與免疫響應相關，外源性的環狀RNA可以通過激活模式識別受體RIG-I刺激哺乳動物細胞的免疫信號。之前的研究認為細胞區分內源性和外源性環狀RNA的能力依賴于環狀rna側面的內含子序列和剪接機制，但是近期研究發現與之矛盾的結果，即外源性環狀RNA不激活細胞RNA傳感器，如toll樣受體和RIG-I。本綜述認為，在以前的研究中，使用RNase R生成的circRNA制劑中的雜質可能激活了RNA傳感器，因為即使是少量污染的線性dsRNA(其中一些可能含有三磷酸化的dsRNA)也能激發強大的細胞免疫反應。

　　環狀RNA的編碼功能

　　由于circRNAs不含5’帽子，它的翻譯是帽子獨立的。某些circRNAs具有內部核糖體進入位點（IRES）或者在5個未翻譯區域(UTR)加入m6A RNA修飾后的方式翻譯。盡管目前有成千上萬的環狀RNA經預測包含一個假定的開放閱讀框(ORF)和一個上游IRES，但是真正能夠作為蛋白編碼模板的，只有circ-ZNF609, circMbl, circFBXW7, circPINTexon2 和 circ-SHPRH，對于它們所產生的肽段的功能也尚不清晰。FBXW-185aa, PINT87aa和SHPRH-146aa作為人膠質母細胞瘤的腫瘤抑制因子發揮功能。另外一些環狀RNA編碼的產物還可能作為防止蛋白降解的保護劑，如SHPRH-146aa可保護全長E3泛素蛋白連接酶SHPRH蛋白不被DTL泛素化并降解。環狀RNA衍生肽也可以在不同的條件下表達，如在細胞應激時，或在典型蛋白的不同細胞間隔中發揮作用，從而作為細胞內的調控蛋白產物。

四 研究環狀RNA的功能的策略

　　類似于線性RNA和其它非編碼RNA，研究人員均試圖通過實驗操縱環狀RNA的表達水平和表征它們的相互作用來闡明環狀RNA的功能。但是研究環狀RNA有一定的難度，因為環狀RNA可能會干擾來自同一位點的線性轉錄本的研究。本文就研究環狀RNA特征的一些研究方法進行討論。

　　研究環狀RNA-miRNA相互作用的方法

　　證明環狀RNA作為miRNA海綿的功能是具有挑戰性的。在環狀RNA中存在假定的miRNA結合位點并不一定意味著環狀RNA抑制這些miRNA。首先，可能需要考慮海綿中miRNA結合位點與靶mRNA之間的化學計量關系；同時，環狀RNA需要具有多競爭性miRNA結合位點。Argonaute-交聯免疫沉淀或Argonaute免疫沉淀常被用于證明環狀RNA是否具有真正的miRNA海綿作用。但該方法的缺陷是不能區分與之結合的是線性還是環狀RNA。因此，還需要經特殊引物設計的RT-qPCR進行量化。此外，單純的結合還不能說明環狀RNA就是miRNA的海綿，同時還需要證明Ago-環狀RNA的聯系是隨著miRNA的表達水平發生變化的。

　　研究環狀RNA-蛋白相互作用的方法

　　評估環狀RNA蛋白相互作用的方法是基于環狀RNA (以RNA為中心)或蛋白(以蛋白為中心)的分離，然后分析分離組分的相互作用。在以RNA為中心的方法中，利用RNA反義純化、RBPs的綜合鑒定或RNA目標的捕獲雜交分析等技術，利用反義探針從細胞裂解液中提取環狀RNA及其相關蛋白。環狀RNA相關蛋白可通過低通量方法(如western blot)或高通量方法(如質譜分析)進行分析。在以蛋白為中心的方法中，免疫共沉淀可采用針對該蛋白的抗體，與該蛋白相互作用的環狀RNA可以通過特定于位點的方法或高通量方法(如RNA-seq)進行分析。為了利用基于交聯免疫沉淀(CLIP)的方法在環狀RNA上繪制精確的蛋白結合位點，必須在免疫沉淀前有效地去除線性RNA。

　　研究環狀RNA翻譯的方法

　　大多數環狀RNA是由編碼蛋白質的基因產生的，環狀RNA中假定的ORF與相應mRNA序列中的典型ORF經常重疊。因此，只有BSJ下游的序列和假定的終止密碼子之前的序列，才能用于確定蛋白質是來自線性轉錄本還是環狀轉錄本。因此，評估環狀RNA是否被翻譯，可以使用熒光素酶報告基因測定ORF和功能類似的IRES的元件，及通過對m6A甲基化的分析。此外，跨越BSJ的環狀RNA特異性肽段最好采用質譜法檢測。此外，一些最新的研究方法還可以為環狀RNA的ORF終止密碼子前插入蛋白標簽，以利于后續的蛋白鑒定或者細胞定位。還有多聚體分析或核糖體印跡也可以作為研究環狀RNA翻譯的方法。

　　RNAi敲低環狀RNA的方法

　　為驗證目的環狀RNA的功能，可以使用RN干擾技術來有效沉默或抑制環狀RNA的表達，即由siRNA/shRNA與環狀RNA結合并使之降解。針對環狀RNA BSJ的siRNAs通常對環狀轉錄本有效且特異性強，使用化學修飾的siRNAs，如鎖定核酸和解鎖核酸可以提高敲除效率或減少脫靶效應。但是針對BSJ時，設計空間受到限制，使用passenger disabled siRNA可能效果較好。由于siRNAs依賴于高轉染效率，且具有瞬時轉染的特點。相比之下，采用shRNAs或者AgoshRNAs可能會更穩定地敲低環狀RNA。

　　敲除環狀RNA的方法

　　由于大多數環狀RNA來自于編碼蛋白質的宿主基因，這使得環狀RNA特異性敲除較為復雜。即使對于沒有注釋宿主基因的環狀RNA，如ciRS-7，在敲除環狀RNA時也應謹慎。由于ciRS-7沒有已知的線性宿主基因，因此通過去除產生環狀RNA的外顯子，產生了一個ciRS-7敲除小鼠模型。然而，最近的分析鑒定出一種與ciRS-7同源的線性RNA，并表明在ciRS-7敲除模型中該線性RNA的穩態水平增加。這一發現提出了一個問題，ciRS-7敲除小鼠的表型是由于ciRS-7丟失還是線性RNA表達增加所導致的。

　　過表達環狀RNA的方法

　　根據內源外顯子環化的原理，構建環RNA過表達載體，研究側翼內含子序列、蛋白因子等對環化的促進或抑制作用，可以探索環狀RNA的功能。互補序列可以發生在重復元件中，例如Alu元件，可以通過獲取上游內含子的一個區域(>30核苷酸)

　　，并將其反向插入循環外顯子的下游來創建互補序列。另一種有利于質粒表達環狀RNA轉錄本的方法是將特定RBPs的結合域包含在側翼內含子中以促進循環。最后，基于轉移RNA剪接機制的方法可以實現環狀RNA過表達。環狀RNA過表達載體包含可環化外顯子和具有反向互補序列的側翼內含子來促使環化剪接，其轉染到細胞中可以主動促進成環。然而，這種方法通常導致環狀RNA表達位點的隨機插入，可能會干擾其他基因。此外還需注意一點，就是線性轉錄本和循環串聯體通常一起產生的，應該對產生的線性和環狀轉錄本的數量進行實驗評估，并謹慎解釋數據。

五 結語

　　環狀RNA研究領域的最新進展已經揭示了環狀RNA生物發生和生物學方面的核心內容，但要了解這些分子在健康組織和疾病中的調控和功能，仍需要進行更加深入的研究。在特定細胞類型或亞克隆中確定空間和時間基因表達模式，特別是在單細胞水平上，將有助于這項工作。目前，單細胞RNA-seq僅在兩個研究中僅被用于檢測環狀RNA，但在未來可能會被更多地用于環狀RNA的生物學研究。另一項很有前途的技術，數字空間剖面是基于NanoString技術的一個名為GeoMx數字空間剖面儀的平臺，該平臺支持在福爾馬林固定石蠟包埋組織玻片上對用戶感興趣的定義區域的蛋白質或mRNA進行高度復用和空間解析的數字分析。在未來，我們希望這項技術能夠應用到對環狀RNA的量化。最后，Oxford Nanopore MinION技術已經被用于環狀RNA的擴增測序，并有望在不久的將來應用于全基因組的環狀RNA測序，該技術可以提供非常長的讀序，因此可以解決內部剪接模式的問題。

　　對環狀RNA的研究給我們帶來了許多令人驚訝的發現，這意味著環狀RNA在生物學和病理生物學中具有重要的意義。RNA-seq已經在不同的組織和疾病中發現了數千種環狀RNA，然而其中絕大多數還沒有得到其它技術的驗證或功能研究。本綜述中描述的技術將會促進RNA-seq數據的有效驗證，并有助于揭示環狀RNA生物學的新方面。