血清學實驗—玻片凝集與肥達反應

【材料】
傷寒桿菌，甲、乙型副傷桿菌，痢疾桿菌診斷血清，載玻片，生理鹽水等。
【方法與結果】
根據初步鑒定結果，用已知診斷血清作玻片凝集試驗，如發生凝集，即可確定。如疑集陰性，應復查后再定。
（二）繼續鑒定：根據需要可進一步作生化反應，血清學分型等鑒定。
【注意事項】
1. 作分離培養時宜取膿血便接種于鑒別培養基或選擇培養基上。
2. 挑取可疑菌落時，每份標本可選取2~3個菌落，每個菌落接種一支雙糖管。
3. 玻片凝集確定后，如果需要，可保存菌種，以便進一步鑒定和研究用。
《附錄》
1、伊紅美蘭（簡稱EMB）培養基制備
1） 成份：
① pH7.6%無糖瓊脂  100毫升
② 20%乳糖溶液 2毫升
③ 2%伊紅水溶液 2毫升
④ 0.5%美蘭水溶液 1毫升
2）制法：將上述成分混合溶化，8~10磅高壓蒸氣滅菌15分鐘，制成平板備用。
3）應用原理：培養基中含有乳糖，伊紅及美蘭指示劑，伊紅系酸性染料，當大腸桿菌分解乳糖產酸時，細菌  帶正電荷，而染上伊紅，伊紅與美蘭結合形成紫黑色化合物，所以菌落呈出紫黑色，且有金屬光澤；致病菌不分解乳糖故其菌落不變色，較透明，培養基中加入的染料還可抑制其他革蘭陽性菌生長。
2、雙糖鐵培養的制備
1） 成分：
牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，硫代硫酸鈉0.05g，硫酸亞鐵0.5g，葡萄糖0.1g，乳糖1g，瓊脂1g，酚紅0.025g，蒸餾水100ml。
2） 制法：將上述成分（除瓊脂及酚紅）混合，加熱溶化，矯正PH至7.4~7.6。再加入瓊脂及酚紅，煮沸，分裝小試管內，每支約2ml，經10磅15分鐘后，置成高層斜面，冷凝后即成。
3） 使用原理：克氏雙糖鐵培養基中含有葡萄糖、乳糖、硫酸亞鐵及酚紅指示劑等成份。經菌分解葡萄糖產酸時，使培養基的下層由紅變黃，斜面培養基中雖然也含有葡萄糖但量小，且分解產生的酸為揮發性酸，所以只發酵葡萄糖的細菌斜面仍為紅色；產酸并產氣時，培養基中有氣泡或裂隙出現。培養基中乳糖含量大，被分解后產酸多，因此不僅培養基下層變黃，而且斜面出由紅變黃，基于上述現象，通常將培養基的斜面部分代表乳糖，下層部分代表葡萄糖。培養基中含有硫酸亞鐵，如有硫化氫產生，則生成黑色硫化鐵，使培養基中出現黑色。
三、肥達反應
【原理】
肥達試驗是一種試管凝集反應。用已知的傷寒桿菌O、H抗原  和甲、乙型副傷寒桿菌H抗原，與病人血清作定量凝集試驗，以測定患者血清中無相應抗體存在，作為傷寒、副傷寒診斷的參考。
【材料】
1.患者血清1：10稀釋
2.傷寒桿菌O菌液、H菌液、甲、乙型副傷寒H菌液
3.生理鹽水、試管、吸管、56℃水箱等
【方法】
1.取清潔小試管32支，分成4排，每排8支，依次編號。
2.于小試管內各注入0.5ml生理鹽水。
3.于每一排第一管內加入1：10稀釋的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混勻，吸出0.5ml注入第二管作對倍稀釋，……依次稀釋至第7管，棄去0.5ml，第8管為對照。
4.從第8管開始，從后向前，第一排各管內注入傷寒桿菌H菌液0.5ml；第二排各管注入傷寒桿菌O菌液0.5ml；第三排各加入甲型副作寒桿菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副傷寒桿菌H菌液0.5ml；
5.加完菌液后，振蕩試管架，混勻，置于56℃水浴箱2~4小時，放冰箱過夜，或放置37℃水浴箱18小時后觀察結果
肥達氏反應操作表 單位:ml                       
【結果與分析】
先觀察對照管，正確結果應無凝集現象，再觀察各試驗管的凝集現象，凝集程度以“+”多少表示之。
（++++）最強，上液澄清，細菌全部凝集沉淀于管底。
（+++）強，上液輕度混濁，細菌大部分凝集沉淀于管底。
（++）弱，上液混濁，細菌少部分凝集。
（-）不凝，液體呈乳狀與對照管相同。
效價判定：以能出現“++”凝集現象的血清最高稀釋度為該血清的凝集效價。