熒光顯微鏡檢測支原體
| 實驗方法原理 | 檢測支原體有兩種不同的策略：第一種方法將在下述方案中述及，利用對 DNA 染色的熒光染料 Hoechst 33258, 它對細胞核周圍（在細胞表面或胞質中）的特殊物質進行染色，可顯示支原體污染；第二種方法是利用 DNA 探針識別細胞提取物中的 DNA 支原體特異序列，進行支原體污染的檢測。對這個方案，照試劑供應商（fisher Scientific) 的說明進行。 |
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| 實驗步驟 | 1) 準備下列液體，然后除菌并冷藏。 無酚紅的 HBSS NaCl 8 g KCl 0.4 g CaCl2 0.14 g MgSO4?7 H2O 0.1g MgCl2?6 H2O 0.1g Na2 HPO4?2 H2O 0.06 g KH2PO4 0.06 g 葡萄糖 1.0 g NaHCO3 0.35 g dH2O 1000 ml Hoechst 1000x 貯存液 檸檬酸/磷酸鹽緩沖液（2X) 0.1mol/L 檸檬酸 22.2 ml 0.2mol/LNa2 HPO4 27.8 ml 用檸檬酸或 Na2 HPO4 調節 pH 為 5.5。 2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化細胞于培養皿中的 Labtek 玻片上或蓋玻片。 3) 加人 1~2 ml 培養液覆蓋表面，讓細胞生長 2~3 天。 4) 準備 Camoy 固定液（應在每次用前制備新鮮的)。 Camoy 固定液 3 份甲醇 1 份冰乙酸 5) 吸干培養液，不用洗涂單層細胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室內或培養皿中。培養皿中充滿 Camoy 固定液（約 5 ml）室溫中放置平皿 2 分鐘。 6) 去除培養皿中液體，加人新鮮固定液以充滿室內或培養皿中（約 5 ml)。室溫中放置平皿 5 分鐘。 7) 重復歩驟 6。 8) 去除固定液，去除 Labtek 室的塑料外套或將培養皿的玻片拿出，讓細胞在室溫中晾干 30 分鐘或更長。 9) 用 Hoechst1000x 儲存液（步驟 1) 配制 Hoechst 工作液。 Hoechst 工作液 工作液宜每次新鮮配制 用 10ml HBSS 稀釋 0.1 ml Hoechst 儲存液（0.5ug/ml) 用 5 ml HESS 稀釋 0.5 ml Hoechst 儲存液（0.05ug/ml) 或 用 50 mlHBSS 稀釋 50ul Hoechst1000x 儲存液；每 Coplin 染缸中加人 40 ml。 10) 室溫條件下，在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液（終濃度為 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分鐘。 11) 用 dH2O 漂洗兩次。 12) 等體積混和甘油、梓檬酸/磷酸緩沖液（在步驟 1 中制備），制備封閉培養液以覆蓋住細胞。 13) 在玻片和蓋玻片之間加入 2 滴封閉培養液，用紙巾輕輕吸出多余液體。 14) 用橡膠黏合劑封閉玻片和蓋玻片。 15) 用熒光顯微鏡觀察標本。應用激發波長為 330/380nm 和光柵過濾器 LP440nm。 |
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