長白豬精原細胞的分離和純化

長白種系公豬                                                          

膠原酶                                                                  胰蛋白酶                                                                  脫氧核糖核酸酶                                                                  牛血清白蛋白                                                                  胎牛血清                                                                  RPMI 1640培養基                                                                  HE染液                                                                  PBS                                                          

細胞沉降池                                                                  離心管                                                                  吸管                                                                  篩網                                                                  梯度發生器                                                                  離心機                                                                  光學顯微鏡                                                          

一、材料和方法

1、實驗動物

長白種系公豬，2月齡，由北京養豬中心葦溝現代化豬場提供。取活體睪丸，立即放入1640營養液中，待分離細胞。

2、主要試劑及材料

膠原酶（CLS，Sigma），胰蛋白酶（Sigma），脫氧核糖核酸酶（DNase,Promega），牛血清白蛋白（BSA，中國醫學科學院天津血液研究所），胎牛血清（FBS，Gibco），RPMI 1640培養基（Gibco，臨用前配制，加鏈霉素及青霉素至終濃度分別為100mg L及80IU ml，調pH至7 3），其他化學試劑均為國產分析純。800ml容量的細胞沉降池（定做）。實驗用金屬及玻璃器皿用前均清洗干凈并高壓滅菌處理。

3、石蠟切片的制備及染色

新鮮睪丸除去包膜及白膜，切取0.5~1.0cm3左右的小塊，立即置入Bouin固定液中，4℃固定24h。按常規步驟制作石蠟切片，HE染色。

4、單細胞懸液的制備

無菌操作置睪丸于PBS溶液中，小心切開包膜，除去脂肪、附睪及白膜，切取1g左右睪丸組織，用彎剪剪成1mm3大小的碎塊，移入離心管，加5ml含0.5g/L膠原酶的PBS，33℃溫育15min，其間不斷震搖并用吸管吹吸數次。靜置4~5min，待組織和細胞沉降管底后，棄上清。重復上述步驟1次。加入5ml含0.5g L胰蛋白酶和1.0mg/LDNase的PBS，33℃，溫育15min，吸管輕輕吹打3min直至滴片鏡檢時視野中全是散在的單細胞及少量小的細胞團。1000r/min離心10min，棄上清，并用PBS清洗兩次，細胞沉淀最后重懸在含0.5%BSA的PBS中，100目篩網過濾，制成單細胞懸液并進行細胞計數。

5、細胞的沉降分離

固定沉降池并保持水平狀態，池底下口周圍加數十粒硅化玻璃珠。10mlPBS及10ml待分離的單細胞懸液按先后從底部下口載入沉降池。用1640培養液分別配制4%和2%的BSA溶液各250ml，同時分別倒入梯度發生器的兩個容器中。梯度發生器出液口直接用橡膠軟管連接于沉降池的底部尖嘴下口。打開活塞，調整流速，使BSA溶液以15ml/min的速度從底部進入沉降池。最終沉降池內的液體從上而下形成2%~4%的BSA連續梯度。整個沉降系統4℃靜置3h，以使細胞按不同大小在BSA連續梯度介質中通過自然重力沉降而分層。分層后的細胞溶液從沉降池底部下口用自動收集器收集，控制流速為5ml/min，10ml 管作為1份。1000r/min離心10min，沉淀細胞，棄上清。細胞重懸于0.5ml含0.5%BSA的1640培養液中。將各管細胞分別滴片，HE染色，光學顯微鏡下檢測細胞的形態結構特征及均一程度，以確定細胞的類型及純度。合并同類細胞，取1滴細胞懸液，加10μl0.4%臺盼藍，計細胞總數及死亡細胞百分比。最后調整細胞濃度為106個/ml。滴片，染色。顯微鏡下任選5個視野，計算細胞純度。

6、細胞的貼壁培養及純化

經沉降分離的精原細胞中混有少量支持細胞及間質細胞，將此細胞懸液接種到一次性無菌培養瓶中，于37℃、5%CO2及飽和濕度等條件下培養6~8h，支持細胞和間質細胞貼壁而精原細胞尚未貼壁，輕輕搖動培養瓶使精原細胞充分懸浮，吸出培養液，顯微鏡下再次檢測細胞純度及數量，并計算均值。

二、結果和討論

1、石蠟切片的觀察

在400倍光學顯微鏡下觀察2月齡未成熟公豬的睪丸組織石蠟切片。此時的睪丸組織主要為間質及剛剛發育的曲細精管。間質組織主要由間質細胞組成；曲細精管上皮主要由緊貼基膜的精原細胞以及支持細胞組成，兩者均由原始精原細胞分化而來，尚未見初級精母細胞。從切片可見2月齡豬曲細精管尚未發育形成管腔。

2、重力沉降分離后的細胞分類及純度

未成熟豬睪丸組織的單細胞懸液經BSA連續梯度沉降分離后，根據其形態特征可將收集的細胞合并為4類。第2~15份合并為第Ⅰ類細胞，20~33份合并為第Ⅱ類，38~44份合并為第Ⅲ類，46~50份合并為第Ⅳ類。它們的主要組成、細胞純度及活細胞比例等詳見附表。其中第Ⅱ類為我們所要的精原細胞，純度達到91%。細胞組成cells純度（%）purity（%）存活率（%）viability（%）Ⅰ細胞團（cellclumps）-95Ⅱ精原細胞（spermatogonia）9197Ⅲ支持細胞（sertolicells）9597Ⅳ細胞碎片及非細胞結構（cytoplasm）--  本實驗中所獲得的第Ⅳ類組分屬于一種直徑只有2~3μm的非細胞結構物質，著色較深，無細胞核及胞質內含物。Bellve等在分離幼年小鼠的生精細胞時也分離到類似結構和特征的物質，并命名為cytoplasm.我們在分離成年小鼠及豬的睪丸生殖細胞時也得到了此類物質，說明它的存在在豬和鼠之間沒有動物種屬和發育階段的特異性。其來源、功能及超微結構尚未見報道。3 貼壁培養后的細胞純度

間質細胞和支持細胞在體外培養時容易貼壁。我們將BSA重力沉降分離后獲得的精原細胞（其中少量的雜細胞主要為支持細胞，還有個別間質細胞）接種于培養瓶中，6~8h后，支持細胞和間質細胞貼壁生長而精原細胞仍呈懸浮狀態。利用此選擇性貼壁法可將精原細胞進一步純化。收集懸浮精原細胞并經HE染色，在光學顯微鏡下任選5個視野，細胞純度分別為93%、94%、96%、93%及95%，平均值為94.2%，高于沉降分離后91%的純度。

4、光學顯微鏡下2月齡豬睪丸組織各類細胞的形態學鑒定

顯微鏡下可見精原細胞呈圓形或卵圓形，直徑11~13μm，胞質少，核大，核內常染色質占多數，近核膜處由2~4個核仁。支持細胞外形不規則，胞質多且著色淺，核小，核內染色質少，近核膜處染色質較多，1~2個核仁，培養時先于精原細胞貼壁，貼壁后鋪展成梭形或多角形，上述細胞形態特征與2月齡豬睪丸組織石蠟切片的細胞形態完全一致。我們曾采用不同的方法及介質用于幼年豬精原細胞的分離，試圖找到一種最佳分離方法。本實驗方法的建立，對獲得哺乳動物高純度的生精細胞，進一步深入研究精子發生的分子機制以及分離和培養生精干細胞等方面都有重要的參考價值。

1.  實驗過程要注意無菌操作。

2.  操作全程應盡可能短時間內完成，以免增加死細胞數。

來源《長白豬精原細胞的分離和純化》