哺乳動物組織/組織培養細胞
爪蟾卵母細胞
果蠅胚
SPISULA
| 實驗材料 | 組織 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 溶液 H |
| 儀器、耗材 | 尼龍網 勻漿器 |
| 實驗步驟 | 組織制備 1. 切碎組織，用加 250 mmol/L 蔗糖的 H 溶液清洗組織/組織培養物： 溶液 H： 15 mmol/L PIPES，pH 7.2 80 mmol/L KCl 15 mmol/L NaCI 0.5 mmol/L 精咪 0.2 mmol/L 精胺 1 mmol/L DTT 1 mmol/L PMSF 細胞勻漿 2. 清洗后，在二倍體積的含 250 mmol/L 蔗糖的溶液 H 中機械破碎細胞。 純化細胞核組分粗品 3. 將細胞勻漿粗品用幾層（例如 4 層）溶液 H 浸透的 eheesecloth 或 120 μm 尼龍網過濾。 4. 過濾后，加入 6 倍體積含 2.3 mol/L，蔗糖的溶液 H（加入溶液的蔗糖終濃度為 1.62 mol/L，一共為 9 倍體積的含蔗糖的溶液 H），然后用 Sorvall SS34 轉頭在 15000 r/min 離心 30 分鐘從稀釋的濾液粗品中收集細胞核。 制備純細胞核 5. 在一個帶寬松結合（B）研杵的 Dounce 勻漿器中用 4 倍體積的含 1.0 mol/L 蔗糖的溶液 H 重懸浮細胞核沉淀粗品。 6. 重懸浮的沉淀中加 6 倍體積含 2.3 mol/L 蔗糖的溶液 H，充分混勻（加入的溶液中的蔗糖終濃度為 1.78 mol/L；總共為 10 倍體積的含蔗糖的溶液 H）。 7. 在每一離心管異質同晶聚合物超速離心管底部加入 4 ml 含 2.0 mol/L 蔗糖的溶液 H；上面加 34.5 ml 的重懸浮細胞核；用 Beckman SW27 或于與之對等的轉頭在 25000 r/min 離心 60 分鐘。 用 DNA 酶Ⅰ處理純化的細胞核 8. 離心后，用 0.25 倍體積的 0.1 mmol/L MgCl2，292 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 8.5 溶液重懸浮經過蔗糖分部梯度純化的細胞核（細胞核終濃度以光吸收法測定為 100 A260單位/ml）。重懸浮后立刻再用 0.1 mmol/L MgCl2，292 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 8.5 溶液稀釋到 20A260 單位/ml。 9. 進行第一次 DNA 消化，加入 DNA 酶Ⅰ至終濃度為 1 μg/ml，22℃ 消化 15 分鐘。 10. 經 DNA 酶Ⅰ第一次消化后的細胞核懸浮液下面加 0.25 倍體積的 0.1 mmol/L MgCl2，876 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 7.5 溶液，用 Sorvall HB-4 懸桶式轉頭 11000 r/min 離心 10 分鐘。 11. 用最小體積（例如，0.025 倍體積）的溶液 J 重懸浮細胞核沉淀。然后用溶液 J 稀釋至終體積為用來進行第一次 DNA 酶Ⅰ消化所用體積的 1/5。 溶液 J： 0.1 mol/L MgCl2 292 mmol/L 蔗糖 10 mmol/L 三乙醇胺，pH 7.5 12. 加入 DNA 酶Ⅰ至終濃度為 5 μg/ml，22℃ 消化 15 分鐘進行第二次 DNA 消化。 用非離子活化劑和 NaCl 抽提 DNA 酶Ⅰ處理的細胞核 13. 離心回收消化的細胞核：經 DNA 酶Ⅰ第二次消化后的細胞核懸浮液下面加等體積的 0.1 mmol/L MgCl2，876 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L 三乙醇胺-HCI，pH 7.5 溶液，用 Sorvall HB-4 轉頭 11000 r/min 離心 10 分鐘。 14. 在得到的沉淀中加 0.225 倍體積的溶液 J，在勻漿器中用寬松結合的研杵 (B) 重懸浮細胞核。 15. 在重懸浮細胞核組分中加入 0.025 倍體積的 20% (w/v) Triton X-100 使其終濃度為 2% (w/v)，冰上孵育 10 分鐘。 16. 下面不加其他溶液，用 Sorvall HB-4 轉頭 11000 r/min 離心 10 分鐘回收細胞核，用 0.25 倍體積的溶液 J 在 Dounce 勻漿器中用寬松結合的研杵（B）重懸浮含有經 DNA 酶 Ⅰ處理，非離子活化劑抽提過的細胞核的沉淀組分. 17. 在重懸浮細胞核中加入 0.25 倍體積的冷含 100 mmol/L 三乙醇胺-HCl，pH 7.5 的 2 mol/L NaCl，使 NaCl 的終濃度為 1 mol/L，冰上孵育 10 分鐘。 18. 用 Sorvall HB-4 轉頭 11000 r/min 離心 10 分鐘回收核膜孔復合物-核纖層，用最少體積（例如，0.25 倍體積）的溶液 J 重懸浮。 |
