實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
|---|---|
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 這里所述的方法概括為下列幾個步驟：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性組分中的蛋白質（見
24. 3.1 )；固相金屬螯合親和層析（IMAC) 富集磷酸肽（見 24. 3. 2 )；用串聯質譜對磷酸肽進行鑒定和測序（見 24. 3.
3 )；使用穩定同位素標記的磷酸肽的相對定量分析（見 24.3.4 )；用液相色譜-質譜（LC- MS) 確定蛋白磷酸化率（見 24.3. 5
) 。 3.1 細胞亞組分的胰蛋白酶消化酶解 1. 膜組分的胰蛋白酶消化酶解 膜表面結合肽的分離： ( 1 ) 用含 10 mmol/L NaF ( 見注釋 2 ) 的 25 mmol/L NH4HCO3 ( 見注釋 1 ) 溶液清洗分離出來的膜制備物兩次。 ( 2 ) 用含 10 mmol/L NaF 的 25 mmol/L NH4HCO3 懸浮膜制備物，得到總蛋白濃度為 10~15 mg/ml ( 或者光合膜的葉綠素濃度為 2~3 mg/ml) 。 ( 3 ) 在膜懸液中加入 DTT 至終濃度為 1 mmol/L，加碘代乙酰胺至終濃度為 3 mmol/L，還原和烷基化半胱氨酸殘基（見注釋 3) 。 ( 4 ) 用測序級胰蛋白酶 [ 5 μg 胰蛋白酶/mg 葉綠素，或 1 μg 胰蛋白酶/mg 蛋白（見注釋 4)]，22°C 消化酶解膜懸液 3 h ( 見注釋 5)。 ( 5 ) 凍、融消化酶解物，15000 g 或更高轉速離心 20 min。 含有膜中釋放出來的肽段的上清液可直接用來質譜分析，或通過 IMAC 富集磷酸肽。 2. 可溶性組分的胰蛋白酶消化酶解 ( 1 ) 用含 10 mmol/L NaF 的 25 mmol/L NH4HCO3 懸浮蛋白質，蛋白質終濃度為 1~10 mg/ml。 ( 2 ) 在懸液中加入 DTT 至終濃度為 1 mmol/L，加碘代乙酰胺至終濃度為 3 mmol/L，還原和烷基化半胱氨酸殘基。 ( 3 ) 用測序級胰蛋白酶在 37°C 消化 24 h。酶的添加量應為蛋白質總量的 1%~3% ( 通常 100 μg 蛋白質加 2 μg 胰蛋白酶)。 3.2 用固相金屬螯合親和層析法富集磷酸肽 富集的磷酸肽有助于之后對其進行質譜鑒定和測序。由于帶負電荷的含磷基團與 Fe (III) 結合，磷酸肽的富集可在固相金屬螯合親和層析柱中經過親和層析富集。酸性條件下（MeOH/HCl）自由羧基酯化會掩飾負責非特異性結合所有酸性肽的羧基基團的負電荷，因此，酯化，尤其是甲基化能增加磷酸肽的特異性富集 [12] 。 1. 胰蛋白酶酶解多肽的甲基化 ( 1 ) 真空離心干燥從 300 μg 蛋白質樣品中（或 50 μg 光合膜葉綠素）獲得的胰蛋白酶消化肽。 ( 2 ) 在 500 μl 甲醇溶液中不斷攪拌滴加 80 μl 乙酰氯，配制 2 mol/L 鹽酸甲醇溶液。滴加 300 μl 2 mol/L 鹽酸甲醇溶液到被真空離心干燥的肽樣品中。室溫下溫浴 2 h 進行酯化反應。 ( 3 ) 真空離心干燥酯化了的肽。 2. IMAC ( 1 ) 將 8 μl 螯合瓊脂糖凝膠（Chelating Sepharose Fast Flow ( Amersham) ) 珠子懸浮液填裝到 GELoader 槍頭，制作微型柱。 ( 2 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V）乙酸沖洗柱子兩次，并用 100 μl 0.1 mol/L FeCl3 為柱子掛上電荷（見注釋 6) 。 ( 3 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V ) 乙酸沖洗柱子將未結合的 FeCl3 沖洗掉。 ( 4 ) 將甲基化的胰蛋白酶消化肽樣品溶解在 5 μl 甲醇/水/乙腈（1 : 1 : 1 ，V/V )中，將溶液加載到柱子上，孵 育 15 min。 ( 5 ) 用 20 μl 0.1% (V/V) 乙酸沖洗柱子兩次。 ( 6 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V) 乙酸，20% 乙腈水溶液沖洗柱子兩次。 ( 7 ) 用 20 μl 20% 乙腈水溶液（V/V ) 沖洗柱子兩次。 ( 8 ) 用 40 μl 20 mmol/L Na2HPO4，20% 乙腈水溶液洗脫磷酸肽。 通過 IMAC 富集的磷酸肽可以直接在 LC-MS 上分析。但是，如果不經過預先的液相色譜（LC ) 分離，而直接進行電噴霧質譜（ESI- MS) 分析的話，磷酸肽要先用 ZipTiPC18 ( Millipore公司）柱子進行脫鹽處理。 3. 用 ZipTipC18 對磷酸肽脫鹽處理 ( 1 ) 將從 IMAC 洗脫下來的肽樣品經真空離心干燥，去除乙腈，用 10 μl 0.1% TFA 水溶液溶解干燥的肽樣品。 ( 2 ) 用 10 μl 移液器吸取 50% 的乙腈水溶液潤濕 ZipTipC18 柱子，反復潤濕 3 次。 ( 3 ) 用移液器吸取 0.1% TFA 水溶液平衡 ZipTip 柱子，反復平衡 3 次。 ( 4 ) 吸取肽樣品加到 ZipTip 柱子上，讓肽樣品結合到柱子上，重復加樣 10 次，使肽樣品最大程度地結合在柱子上。 ( 5 ) 用 0.1% TFA 水溶液清洗 ZipTip 柱子。重復沖洗 5 次。 ( 6 ) 用 10 μl 50% 的乙腈水溶液將脫鹽的肽樣品洗脫到一只干凈的試管中（見注釋 7)。反復洗脫 10 個循環。 3.3 用電噴霧質譜進行磷酸肽測序 ( 1 ) 質譜分析是在一個配備了納升電離源的混合（四極桿-時間飛行）串聯質譜儀上進行的。 ( 2 ) 將 2 μl 經過 ZipTips 柱子，用 50% 乙腈水溶液和 1% 甲酸（見注釋 8 ) 脫鹽的 肽樣品上樣到納升電噴霧毛細管（見 24.3.2 節 2) 。 ( 3 ) 先記錄陽離子模式完全掃描譜。 ( 4 ) 這個掃描譜上顯示出的每個肽離子（見注釋 9 ) 是受到碰撞誘導解離產生的。 ( 5 ) 裂解譜通過檢測磷酸中性丟失特征信號，鑒定磷酸肽以及確定磷酸化殘基。在碰撞引發裂解后，磷酰基團和一個肽之間形成的磷酯鍵較肽鍵不穩定，導致帶正電荷的含磷酸化殘基的肽離子發生磷酸 H3PO4 ( 98Da) 中性丟失 [ 7，13]。磷酸中性丟失發生在選擇母離子和含有磷酸化殘基的碎片離子上。 ( 6 ) 質譜圖要對以下片段的譜值進行驗證：含磷酰基（含磷酸化殘基的肽段增加了 80 Da ) 的 Y ( C 端）和 B ( N 端）碎片離子和發生 98 Da 中性丟失的衛星碎片離子（丟失磷酸的肽段) 。 ( 7 ) 同時，質譜圖還要對從不含磷酸化殘基的肽段發出的互補離子信號進行驗證，對每個頻譜的解釋可以完成包括磷酸化位點的肽序列分析工作（甚至從頭測序工作) 。 ( 8 ) 肽的鑒定也可以通過把實驗中得到的裂解片段譜圖提交到一個使用 Mascot 服務器的數據庫中進行檢索（ http: //www. matrixscience.com/) 。設置 Mascot MS/MS 離子檢索程序可以讓肽的甲基化和磷酸化包括在檢索范圍內。 3.4 磷酸化肽的相對定量 肽的性質及其電離特性決定用質譜檢測的肽離子強度。因此，不同肽段的定量比較 是不可能的。但是，質譜檢測結合穩定同位素標記技術可以用來對兩個完全不同的蛋白 質樣品進行蛋白磷酸化的相對定量分析。這種實驗的路線圖見圖 24-1A。通過鹽酸甲醇 酯化同時標記兩個等量肽樣品，它們是在不同條件下生長的植物的同一組織或細胞組分中獲得蛋白質的胰蛋白酶消化酶解產物，用甲醇-d3 標記一個樣本，甲醇-d3 標記另一個樣本，分別生成輕、重標記的兩個肽段 [ 14，15 ] 。合并這兩個樣品，運行 IMAC 獲得富含磷酸肽組分。質譜檢測獲得輕、重同位素標記肽（圖 24-1B 和 C) 比例的結果。輕、重同位素標記的肽段的峰面積總和的比值與不同條件下的蛋白質特定位點的磷酸化的差異相關。 ( 1 ) 真空離心干燥胰蛋白酶酶解肽段樣品，它是生長在兩個不同條件下的植物的相同細胞組分的 150 μg 蛋白質的胰蛋白酶酶解產物。 ( 2 ) 邊攪拌，邊滴加 80 μl 乙酰氯到 500 μl 甲醇 - d0 或者 500 μl 氘代甲醇- d3，制備 2 mol/L 鹽酸甲醇輕、重標記溶液。加入 200 μl 2 mol/L 鹽酸甲醇-d0 到干燥肽樣品 1 中，加入 200 μl 鹽酸氘代甲醇-d3 到干燥的肽樣品 2 中。室溫下溫育混合物 2 h，進行釀化反應。   ( 3 ) 混合樣品 1 和樣品 2，真空離心干燥。 ( 4 ) 用 5 μl 甲醇/水/乙腈（1 : 1 : 1，體積比）溶解干燥的肽樣品，運行上述的 IMAC ( 見 24.3.2 節 2 ) 。 為建立內標，需要添加一個額外的實驗。在這個實驗中，兩個樣品分別被以相反的 形式標記，如樣品 1 被輕同位素標記，則樣品 2 就被重同位素標記。接著用重甲醇甲基化樣品 1，用輕甲醇甲基化樣品 2。與內標對比后， “ 直接”標記（圖 24-1B ) 和 “ 反向”標記（圖 24-1C) 的質譜圖顯示相同的磷酸化比例。 3.5 用 LC-MS 測定蛋白質的磷酸化比率 在為從膜中或可溶性（見 24. 3.1 節 2 ) 細胞組分中獲得的肽混合物中的磷酸肽進行質譜分析后（見 24.3.1 節 1) ，每個初始位點的磷酸化的化學計量可通過 LC- MS 確定。該方法是基于測量在混合物中磷酸化肽與非磷酸化肽的比例（見注釋 10)。 ( 1 ) 在這個實驗中，取 20~40 μl 經胰蛋白酶消化的總肽混合物（見 24.3.1 節 1 和 24.3.1 節 2 ) 作為 LC-MS 分析的樣品。用 5 μm 的 C18 MetaChem 150 mmX1.0 mm 柱子以流速 20 μl/min，分離肽樣品組分。 ( 2 ) 用 0.1% ( V/V ) 的甲酸水溶液（A ) 和 0.1%（V/V) 的甲酸乙腈溶液（B) ，按如下時間段用于洗脫：0% B，0~3 min；0~20% B，3~20 min；20%~70% B，20~105 min：70%~99% B，105~115 min。  ( 3 ) 用帶標準離子噴霧源的三重四極桿質譜儀進行肽段在線檢測。采用該設備推薦的設置。 ( 4 ) 在整個 LC-MS 運行過程中連續進行兩個平行的質譜分析：① 在正電離模式下，獲取所有的肽組分頻譜；② 在檢測 m/z=-79 的診斷磷離子的負電離模式下，檢測含磷酸肽的組分（見注釋 11)。 ( 5 ) 兩個平行實驗的結果（圖 24-2A 和 B ) 被存儲為電計算機文檔，如圖 24-2 所示對它們進行分析。 ( 6 ) 首先，要確定已知 m/z 的磷酸肽的洗脫收集點。 ( 7 ) 然后確定那些與非磷酸化肽對應的洗脫峰信號。 ( 8 ) 每個磷酸肽所有電離狀態的峰值強度總和與相對應的非磷酸化肽段的所有電離狀態的峰值強度總和的比值，反映了蛋白質的磷酸化程度。 ( 9 ) 因為同時在同一樣品中被檢測到磷酸化肽和非磷酸化肽，因此來自膜或可溶性組分的樣品中的具體蛋白質的磷酸化化學計量可被測量。 |