實驗方法原理
| 硝酸還原酶（NR）催化植物體內的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，產生的亞硝酸鹽與對－氨基苯磺酸（或對－氨基苯磺胺）及α－萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應如下： | |
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 一、材料儀器設備及試劑 1. 材料：水稻或小麥的葉片、幼穗等。 2. 儀器設備：冷凍離心機；分光光度計；電子分析天平；冰箱；恒溫水浴；研缽；剪刀；離心管；具塞試管；移液管；洗耳球。 3. 試劑及配制: 1μg·ml－1亞硝態氮標準母液配制：準確稱取分析純NaNO2 0.9857g，溶于蒸餾水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即為含亞硝態氮1μg·ml－1的標準液。 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸緩沖液配制：稱取Na2HPO4·12H2O 30.0905g與NaH2PO4·2H2O 2.4965g，加蒸餾水溶解后定容至1000ml。 1％對－氨基苯磺胺（W∕V）溶液配制：稱取1.0g磺胺溶于100ml 3mol·L－1HCl中（25ml濃鹽酸加蒸餾水定容至100ml即為3mol·L－1HCl）。 0.02％（W∕V）萘基乙烯胺溶液配制：稱取 0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml蒸餾水中，貯存于棕色瓶中。 0.1 mol·L－1KNO3溶液配制：稱取 2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸緩沖液。 0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸緩沖液配制：稱取 8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g K2HPO4·3H2O溶于1000ml無離子水中。 提取緩沖液配制：稱取 0.1211g半胱氨酸，0.0372gEDTA溶于100ml 0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸緩沖液中。 2mg·ml－1NADH（輔酶Ⅰ）溶液配制： 4mg NADH溶于2ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸緩沖液中（臨用前配制）。 二、實驗步驟 1. 亞硝態氮標準曲線制作 （1）取7支15ml刻度試管，編號，按下表配制含量為0－2.0μg的亞硝態氮標準液。 加入表中試劑后，搖勻，在25℃下保溫30min，然后以0號管為空白對照，在520nm波長處測定吸光度（A）值 。 （2） 標準曲線繪制 以1～6號管亞硝態氮含量（μg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。 2. 樣品中硝酸還原酶活力測定 （1） 酶的提取 稱取0.5g鮮樣，剪碎于研缽中置于低溫冰箱冰凍30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取緩沖液，研磨勻漿，轉移于離心管中，在4℃，4000r/min下離心15min，上清液即為酶提取液。  （2） 酶促反應 取酶液0.4ml于10ml試管中，加入1.2ml 0.1 mol· L－1KNO3磷酸緩沖液和0.4ml NADH溶液，混勻，在25℃水浴中保溫30min，對照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸緩沖液代替。 （3） 酶活性測定 保溫結束后立即加入1ml 1﹪磺胺溶液終止酶反應，再加1ml 0.02﹪萘基乙烯胺溶液，顯色15min后于4000 r / min下離心15min，以空白管為對照，取上清液在520nm波長處測定吸光度（A）值。 三、 酶活性計算 根據樣品所測得的吸光度（A）值，從標準曲線查出反應液中亞硝態氮含量，按下公式計算樣品中酶活性：  |
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