基因敲除技術

一．概述：

基因敲除是自80年代末以來發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA 同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組外，新的原理和技術也逐漸被應用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA ，它們同樣可以達到基因敲除的目的。

二．實現基因敲除的多種原理和方法：

1．利用基因同源重組進行基因敲除

基因敲除是80年代后半期應用DNA 同源重組原理發展起來的。80年代初，胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到現在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。

(1)利用同源重組構建基因敲除動物模型的基本步驟：

①． 基因載體的構建：把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能，所以一般設計為替換型載體。

②．ES 細胞的獲得：現在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是１２９及其雜合體，因為這類小鼠具有自發突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被發展應用。[2，3]

③．同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導入同源的胚胎干細胞(ES cell)中，使外源DNA 與胚胎干細胞基因組中相應部分發生同源重組，將重組載體中的DNA 序列整合到內源基因組中，從而得以表達。一般地，顯微注射命中率較高，但技術難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。[4,5]

④．選擇篩選已擊中的細胞：由于基因轉移的同源重組自然發生率極低，動物的重組概率為10－2 ～10-5 ，植物的概率為10－4 ～10－5 。因此如何從眾多細胞中篩出真正發生了同源重組的胚胎干細胞非常重要。目前常用的方法是正負篩選法（PNS法），標記基因的特異位點表達法以及PCR 法。其中應用最多的是PNS法。[6]

⑤．表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學形狀的改變，達到研究目的基因的目的。[2，3,7]

⑥．得到純合體：由于同源重組常常發生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。[8]