DNA甲基化研究方法的回顧與評價(圖)

摘要： DNA 甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求。這些方法概括起來可分為三類：整體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。本篇將主要介紹目前存在的大部分DNA 甲基化研究方法，并對其相關特性進行了簡要分析與總結。

關鍵詞 ：表觀遺傳學；DNA 甲基化；甲基化研究方法

早在1942年,C.H.Waddington首次提出表觀遺傳學(epigenetics)的概念,并指出表觀遺傳與遺傳是相對的,它主要研究基因型和表型的關系。幾十年后,霍利迪(R.Holiday)針對表觀遺傳學提出了更新的系統性論斷，也就是人們現在比較統一的認識[1]，即在不改變基因組序列的前提下，通過DNA 和組蛋白的修飾來調控基因表達，這種修飾以DNA 甲基化最為常見。繼人類基因組計劃結束后，2003年人類表觀基因組協會(Human Epigenome Consortium,HEC)宣布開始投資和實施人類表觀基因組計劃(HEP)。

其主要任務是繪制出人類中甲基化可變位點圖譜，即不同組織與疾病狀態下，5-甲基胞嘧啶出現及其分布頻率的圖譜，以指導和系統地研究DNA 甲基化在人類表觀遺傳、胚胎發育、基因印記、等位基因失活及腫瘤發生中的重要作用[2]。DNA 甲基化的研究，逐漸成為新的研究熱點。隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求。讓我們一一介紹現有的大部分DNA 甲基化研究方法，并對其相關特性進行簡要分析與總結。

1導言

1.1 DNA 甲基化及CpG島

DNA 甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA 甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發生于胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉變為5'甲基胞嘧啶。這種DNA 修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調控了基因的表達[3]。脊椎動物基因的甲基化狀態有三種：持續的低甲基化狀態,如管家基因；去甲基化狀態,如發育階段中的一些基因；高度甲基化狀態,如女性的一條失活的X染色體[4]。

哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現的頻率僅有1%，遠低于基因組中的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區域中，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，形成所謂的CpG島[5]。通常，CpG島大約含有500多個堿基。

在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化[6]，CpG島通常位于基因的啟動子區或是第一個外顯子區[7]。健康人中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩定的保留[8]。當腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，以致于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失[9]。

1.2 DNA 甲基化的生物學作用

1.2.1 DNA 甲基化與遺傳印記、胚胎發育

DNA 甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育過程中起著極其重要的作用。研究表明胚胎的正常發育得益于DNA 適當的甲基化。例如：缺少任何一種甲基轉移酶對小鼠胚胎的發育都是致死性的（Li等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印記控制區(imprinting control regions,ICRs)所調控,該區域在雙親中的一個等位基因是甲基化的[4]。印記基因的異常表達可以引發伴有突變和表型缺陷的多種人類疾病。如：臍疝-巨舌-巨大發育綜合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome,BWS)和Prader-Willi/Angelman綜合征等[10]。

1.2.2 DNA 甲基化與腫瘤

甲基化狀態的改變是引起腫瘤的一個重要因素,這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高,從而導致的不穩定(如染色體的不穩定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因的表達)[4]和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發生癌癥的機率提高,例如：胰島素樣生長因子-2（IGF-2）基因印記丟失導致多種腫瘤,如Wilm‘s瘤[11]。

目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因為人們發現腫瘤的發生可能與抑癌基因啟動子區的CpG島甲基化造成抑癌基因關閉有關[12]。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發生的早期預測[13]，而且全的低甲基化也隨著腫瘤發生而出現，并且其隨著腫瘤惡性度的增加而顯著[14] ,因此甲基化的檢測可用于腫瘤的分級。

Shinichi Toyooka描述了腫瘤發生與異常甲基化的關系：被SV40 (Simian Virus 40)感染的人間皮細胞，其端粒酶活性上調，Notch-1基因表達增加，腫瘤相關基因（包括抑癌基因RASSF1A）的啟動子區發生異常甲基化[15]。Cui等發現部分結腸癌患者的正常腸粘液腺細胞的IGF-2基因印記丟失[16]。Uhlmann等發現不同病理類型及不同惡性程度的神經膠質瘤細胞的7種腫瘤標志基因存在著不同程度的甲基化 [17]。因此，甲基化的研究，為腫瘤的早期預測、分類、分級及預后評估提供了新的依據 。

1.3 DNA 甲基化的研究方法

近15年來，人們越來越認識到DNA 甲基化研究的重要性，開發出一系列檢測DNA 的方法。根據研究目的這些方法分為：整體水平的甲基化檢測，特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。根據研究所用處理方法不同可以分為：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性內切酶的甲基化分析方法；基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法和柱層法等。Christina Dahl和Per Guldberg[3]歸納總結了主要的甲基化分析方法及相關特性，在此基礎上我們略加以補充（見表1）。