燕麥轉基因及其在提高滲透脅迫耐受中的應用實驗

實驗材料：燕麥

試劑、試劑盒：

乙醇                                                                  

蒸餾水

Clorox 漂白劑      

儀器、耗材：

培養皿                                                                  

MSI 培養基 

實驗步驟：

1. 芽尖培養

( 1 ) 成熟的燕麥（Ogle、Pacer 和 Prairie ) 種子用于芽尖培養。

( 2 ) 徒手去除種子的外稃和內稃。

( 3 ) 種子用 70% 乙醇（Sigma) 浸泡 5 min 進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水洗一次，再用 20% 的 Clorox 漂白劑浸泡，并在旋轉振蕩器上以 0.5 g 持續振蕩 30 min (VWR International,  Bristol,  CT  06011) (見注  1) ，用無菌蒸餾水洗二次。

( 4 ) 在無菌條件下將種子放入裝有濕潤濾紙的培養皿后，覆蓋一層濕濾紙，將培養皿在 3~5°C 放置 2~3 天以使種子適應處理條件。期間要經常加水保持濕度。

( 5 ) 放置結束后，將 10~12 粒經過消毒的種子放入倒有 MSI 培養基的（25 mL/每皿）無菌培養皿（100 mm x15 mm，直徑x高；VWR ) 中萌發，在生長室或 25°C 生長箱中暗培養一周（見注 2) 。

( 6 ) 種子萌發后，用無菌的刀片（Sigma) 將芽尖切成 3~5 mm 的小段（見注 3) 。

( 7 ) 將 5~7 個切好的芽水平放置在倒有 MS2 培養基的培養皿中（100 mmx15 mm ) ，在 25°C 持續光照條件下培養4 周 [ 60 μmol/( m²·s ) 采用 40W 功率的冷白光 Econ-owatt  熒光燈管，Philips Westinghouse, USA ] ( 見注 4 ) 。

( 8 ) 每周進行一次繼代培養，從培養的芽尖將伸長的葉片、胚芽鞘和莖移除，然后再切成 3~5 mm 的小段。

( 9 ) 每 2 周用 MS2 培養基進行繼代培養以保持叢生芽的生長 [ 圖10.2 (a ) ]。



( 10 ) 培養 8 周后計算每一品種叢生芽的相對分化頻率，即產生叢生芽的芽尖數與培養的總芽尖數的百分比（見注 5 ) 。

2. 微粒轟擊

( 1 ) 取 30 mg 金粉或鎢粉置于 1.5 ml 離心管（VWR) ，加入 1 ml 100% 乙醇髙速渦旋振蕩 30 min 進行消毒，用于基因槍轟擊。

( 2 ) 在振蕩過程中，取 50 μl 微粒乙醇懸浮液到新的離心管中，并用微量離心機(Brinkman,  Westbury， NY  11590)  10000 g 離心 30s，然后加入 1 ml 蒸餾水，渦旋振蕩洗滌并離心。洗兩次后，用 332 μl 無菌蒸餾水重懸微粒。

( 3 ) 在重懸的微粒中加入 15 μl DNA 樣品，其中含有 15 μg 陽摩爾比為 1 : 1 的 pBY520 和 pActl-D 質粒、225 μl 的 2.5 mol/L CaCl₂ (Sigma) 、50 μl 0.1 mol/L 亞精胺 (Sigma) ，室溫下渦旋振蕩 5 min (見注 6) 。

( 4 ) 將微粒- DNA 懸浮液在冰上放置 10 min，然后 10000 g 離心 1 min。

( 5 ) 用 500 μl 100% 乙醇清洗微粒-DNA 沉淀，渦旋振蕩 30s，離心 1 min，然后用 100 μl 100% 乙醇重懸微粒。

( 6 ) 根據大小將 2~3 個叢生芽放置在鋪有 MS3 培養基（25 ml/皿）的培養皿中直徑為 1.5 cm 的區域內，然后將培養皿放在基因槍的終止屏下方（見注7) 。

( 7 ) 吸取 10 μl 微粒-DNA 懸浮液加在載體膜（macrocarriers) 中心，待乙醇揮發后立即用于轟擊（見注 8) 。

( 8 ) 2 h 后對每一個芽尖培養物再進行一次轟擊（見注 9) 。

( 9 ) 將轟擊后的芽尖移到新鮮的 MS2 培養基上（25 ml/皿），在 25°C 持續光照 [ 60 μmol/( m²·s )] 條件下生長 4 周，期間進行一次繼代培養 [ 圖 10.2 ( b ) ]。

3. 轉基因組織的選擇

( 1 ) 4 周后，將基因槍轟擊過的叢生芽分成直徑 5~10 mm 的小塊（避免損傷芽分生組織），然后每皿放 6~8 個芽叢于 MS4 培養基上（25 ml/皿；100x15 ) ，并計算轉基因事件的相對發生頻率（表 10.1)。

( 2 ) 2 周后，將轉基因的芽（綠色的）在新鮮的 MS4 培養基上進行繼代培養，去除非轉基因的芽（黃色或褐色）。

( 3 ) 在 MS4 上選擇培養 4 周后，將綠色的叢生芽分成直徑為 5~10 mm 的芽叢，在 MS5（25 mL/皿，100x20 ) 培養基上繼代生長 4~6 周。

( 4 ) 經過總共 4 個月的選擇和增殖后，將快速生長的叢生芽移至帶有 MS6 培養基（50~70 ml/Magenta) 的  Magenta 盒（99 mmx 68 mm，長X直徑，Sigma；2~3 芽叢/Magenta) 中進行營養生長，然后移至 MS7（50~70 ml/Magenta) 培養基中進行生根培養 [ 圖 10.2 ( c ) ]。

( 5 ) 當轉基因植株長到 5~10 cm 高、有 2~3 個葉片時，移植到含混合土的 8 cm 塑料罐中，其中泥炭和珍珠巖按 1 : 1 混合，每罐一棵。在 16 h 光周期、70%~80% 濕度的溫室中生長直到成熟 [ 圖10.2 (d) ; 見注 10]。

( 6 ) 讓轉基因植株自花授粉結實，收種，按株系獨立保存在 4℃ 和 70% 濕度的環境中。



4. 轉基因遺傳分析

( 1 ) 低溫處理后，種子（每皿 10~12 粒）在 MS7 ( 25 ml/皿）培養基上萌發 1 周，用于分析轉基因的遺傳特性，如在 R。、R1、R2 代中 bar 基因的遺傳穩定性（見注 11)。

( 2 ) 或者在溫室中，利用多孔塑料盤（Griffin   Green  House  and   Nursery  Supplies) 在土中（Metro  Mix 360 Soil) 萌發種子并生長 2 周。用除草劑噴灑生長的植株（見注12)。 

( 3 ) 1 周后，統計選擇培養基上萌發和未萌發的種子數，或溫室中除草劑處理后存活和死亡的植株數。

( 4 ) 采用 X² 檢驗（53 ) 分析轉基因在 R。、R1、R2 代的分離（表 10.2)。



5. 轉基因植株的分子檢測

(1) 聚合酶鏈反應（PCR)

① 轉基因植株中轉基因的檢測（如 bar 和 hav1) : 用葉片遵照 REDExtract- N-Amp  Plant  PCR試劑盒（Sigma- Aldrich， St.   Louis, MO, Cat#  XNA- P ) 的說明書操作提取 DNA。

② 使用正向（F ) 和 反向（R ) PCR 引物：例如，bar- F：5'-ATGAGCCCAGAACGACG-3'；bar- R：5'-TCA  GATCTCGGTGACGG-3'；hva1-R：5' -TGGCCTCCAACCAGAACCAG-3'；hva1- R：5'-ACGACTAAAGGA ACGGAAAT-3’。

③ 在 PCR 儀（如 Per-kin  Elmer/Applied  Biosystem， Foster  City,  CA) 上進行  DNA 擴增。擴增反應起始用 94°C 變性 4 min，隨后 94°C 1 min、55°C 1 min、72℃ 2 min 進行 35 個循環，最后 72°C 延伸 10 min。

④ 在 0.8%  (m/V) 的瓊脂糖凝膠分離并分析 PCR 產物，凝膠用 EB 染色后在紫外燈下觀察。轉基因條帶大小分別是： bar 為 0.59 kb，hva1 為 0.70 kb [ 圖 10.3  ( a ) ]。



(2) Southern  雜交分析

① 用基因編碼區（如 hva1 或 bar1 ) 序列作為探針進行 Southern 雜交 [54]。

② 用 Phytopure 植物 DNA 提取試劑盒（Amersham-Pharmacia  Biotech) 提取轉基因和非轉基因植株的基因組DNA。

③ 用 10 μg R0、R1 和 R2 代植株的基因組 DNA 進行 Southern 雜交分析。

④ 用 HindIII 和 HindIII-BamH I 限制酶酶切消化基因組 DNA，然后在 0.8% 的瓊脂糖膠上電泳分離片段。

⑤ 將膠變性和中和并印跡到 Hybond-N⁺ 膜上（Amersham-Pharmacia Biotech) , 依照 Sambrook 等描述的方法[55]。

⑥ 用 HindIII-BamH I 酶切 pBY520 質粒，在 0.8% 的低熔點膠上分離帶有 hva1 編碼區的片段。切下 1.0 kb 的片段，用 QIAquick PCR 純化試劑盒純化該片段。

⑦ 用 Rad 引物標記試劑盒（GIBC0 BRL) 對純化的基因特異的 DNA 片段進行 [ ³²P] -dCTP 放射性標記，方法參照說明書。

⑧ 按照標準程序[ 55 ] 用 hav1 基因特異探針與準備好的膜進行雜交。

⑨ 隨后，-80°C 條件下用 X 光膠片（Kodak ) 放射自顯影分析雜交膜 [ 圖10.3 ( b )]。

(3) Northern 雜交分析

① 用 TRIZOL (GIBCO BRL) 提取轉基因和非轉基因植株幼葉的總 RNA，方法參照說明書。

② 依照 Sambrook 等的方法在 1.2% 的瓊脂糖-甲醛變性膠中電泳分離 10 μg 總 RNA [55]。

③ 依照 Sambrook 等的方法將股印跡到 Hybond-N⁺ 尼龍膜（Amersham-Pharmacia Biotech) 上 [55]。

④ 按照標準的 Northern 雜交程序 [55]，用 ³²P 標記的基因特異的探針分析 hva1 的轉錄情況 [ 圖 10.3 ( c ) ]。

(4) Western 雜交分析

① 蛋白質提取、Western 雜交和免疫檢測參照 Xu 等的方法[48]。

② 在液氮中研磨約 0.1 g 轉基因和非轉基因植株的新鮮葉片，加入 0.2 ml 蛋白提取緩沖液提取蛋白質。

③ 用 Bio-Rad 蛋白分析試劑（ Bio-Rad) 按 Bradford 的方法測定每一樣品的總蛋白濃度 [56]。

④ 用 12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 100 μg 轉基因和非轉基因樣品的可溶性總蛋白。

⑤ 電泳結束后，使用半干轉移系統（ Bio- Rad ) 將蛋白質電轉到硝酸-纖維素膜上(Amersham-Pharmacia  Biotech) ，方法參照儀器說明。

⑥ 將 Western 膜分別和轉基因特異蛋白（如 HVA1 ) 免疫產生的一抗（ 如兔抗血清）及二抗（帶有堿性磷酸酶的兔 IgG 的抗體，Sigma- Aldrich) 孵育。

⑦ 在堿性磷酸酶的緩沖液中進行膜顯色 [ 圖10.3  ( d ) ]。

6. 轉基因的生化分析

( 1 ) 對轉基因和非轉基因植株的整株或不同的器官進行轉基因的生化分析，如 GUS 分析（圖 10.2 (e )~（h ) ;  [ 48 ] ) 。

( 2 ) 為去除葉綠素，將綠色組織先在 70% 乙醇中浸泡 2 h，然后在 100% 乙醇中過夜處理（此步驟應在在 37℃ 孵育后進行）。

( 3 ) 抽真空以去除組織中的氣體。

( 4 ) 將樣品浸入 GUS 底物中 [ 10 mmol/L EDTA (pH 7.0 ) 、0.1 mol/L NaPO₄  (pH 7.0)、1~5 mmol/L X-Gluc；X-Gluc 可溶解在二甲基亞砜中；Sigma] , 抽真空后立即在 37°C 孵育（57 ) 。

( 5 ) 為了觀察 GUS 表達部位，制作徒手橫切片，然后在 Zeiss SV8 體視鏡或 Zeiss Axioskop 常規顯微鏡下觀察。

7. hva1 轉基因植株在脅迫條件下的評價

(1) 離體培養條件下的鹽脅迫

① 取轉基因和非轉基因每個株系 50 或 60 粒種子的種子；見注 12) 進行表面消毒。每皿 MS7 培養基（25 ml/皿）上播 10~12 粒種子，于 25°C 暗培養萌發 4 天（見注 13)。非轉基因的種子用不加草胺膦或雙丙胺膦的 MS7 培養基。

② 將萌發種子分為兩組，一組不加鹽脅迫而另一組生長在鹽脅迫條件下。

③ 從每一獨立的轉基因和非轉基因株系中移出 4~5 棵正在生長的苗到加有 NaCl 或沒有 NaCl 的 MS8 培養基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25°C 和 60 μmol/( m²·s ) 的光照條件下生長。最少 4 個重復。

④ 6 天后，觀察轉基因和非轉基因植株在加鹽和不加鹽條件下的生長狀況 [ 圖 10.2 ⑴ ] 。

⑤ 進行了測定，如植株鮮重（見注 14 )、株局、根長、干 重（見注 15；表 10. 3) 。



⑥ 對數據進行方差分析 [58]。

⑦ Tukey's 差距檢測法在 95% 置信度水平上比較均值。

⑧ 將植株移栽至泥炭：珍珠巖（1 : 1，V/V ) 混合的混合土中，并在溫室中進一步生長。

(2) 溫室（盆播）條件下的鹽脅迫

① 依照 3.7.1 節中的方法在 MS7 培養基上萌發種子。

② 將 1 周大小經過篩選的轉基因苗和非轉基因對照苗移到小盆（8 cmx 4 cmx 6 cm) 中的混合土中，該混合土中泥炭：珍珠巖為 1 : 1  (每盆一株苗）。

③ 將這些盆放在加水的平底盤中，并在溫室中生長 1 周。

④ 將生長中的苗分成 5 組，每組中轉基因和非轉基因株系分別取 8~10 棵苗。在鹽脅迫處理前測定每一株的株高和葉數。

⑤ 用不同濃度的鹽溶液 （0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L 和 200 mmol/L NaCl) 澆灌植物，每天一次持續 14 天（見注 16)。  

⑥ 隨后用水澆灌 1 周讓植株恢復。

⑦ 之后，重新不間斷進行 5 周鹽脅迫處理。

⑧ 實驗至少進行 4~5 次重復。

⑨ 測定單株株高、根長、分蘗數、單株結實率。比較轉基因和非轉基因植株在脅迫和非脅迫條件下的生長差異 [見注 1 7 ; 圖 10. 2( j ) 和圖 10. 2 ( k ) ] 。

⑩ 對數據進行方差分析統計 [58]。

⑾ Tukey's 差距檢測法在 95% 置信度水平上比較均值（表 10.4 ) 。



(3) 離體培養條件下缺水或滲透脅迫

① 參照 3. 7 .1 節的方法，在 MS7 培養基上萌發種子（R。、R1 、R2) (見注 18)。

② 將萌發的種子分成兩組：一組生長在不缺水或沒有滲透脅迫的條件下，另一組生長在缺水或有滲透脅迫的條件下（見注 19)。

③ 將每一獨立的轉基因和非轉基因株系的 4~5 株苗移到 Magenta 盒中加有甘露醇或沒有甘露醇的 MS9 培養基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25℃ 光照條件下生長。最少 4~5 個重復。

④ 6 天后，分析轉基因和非轉基因植株在滲透脅迫和非滲透脅迫條件下的生長狀況。

⑤ 和鹽脅迫條件下一樣對植株的生長狀況進行測定。比較轉基因和非轉基因植株在脅迫和非脅迫條件下的生長差異（表 10. 3) 。

⑥ 將植株移栽到混合土中，其中泥炭與珍珠巖按 1 : 1 ( V /V ) 混合，使其在溫室中進一步生長。

(4) 溫室（盆播）條件下缺水脅迫實驗

① 參照 3. 7 .1 節的方法，在 MS7 培養基上萌發 30~40 粒種子(見注 20)。

② 將 1 周大小的、經過篩選的轉基因苗與未經篩選的非轉基因苗作對照，移到裝有混合土的小盆中（8 cmx4 cmx6 cm) ，該混合土為泥炭與珍珠巖 1 : 1 混合，每盆栽一株苗。

③ 將盆放置于加水的平底盤中，缺水處理前讓植株在溫室中生長 2 周。

④ 將植株分成加水（a 組）和缺水（b 組） 兩組，每一組中轉基因和非轉基因株系各用 8~10 棵苗。在脅迫處理前測定每一株的株高和葉片數。

⑤ 在 a 組植株的平底盤中加水，持續 1 周。

⑥ 在 b 組植株的平底盤中只加水 2 天。

⑦ 加水 2 天后，完全去除 b 組平底盤中的水，以后的 1 周內處于缺水環境。

⑧ 重復這一過程 5 周。

⑨ 結束后，測定每一株的株高分蘗數。比較轉基因和非轉基因植株在脅迫和非脅迫條件下的生長差異。

⑩ 用方差分析進行數據統計 [58]。

⑾ Tukey's 差距檢測法在 95% 置信度水平上比較均值。