原生質體的培養

原生質體（Protoplast）：指采用機械或酶解法去掉細胞壁的裸露細胞。

一、原生質體的應用
由于沒有細胞壁，原生質體為作物遺傳改良和植物學研究提供了極為有利的試驗材料。原生質體可以用于下面幾種研究。
1.  用作細胞雜交服務于作物改良

2.  用作遺傳轉化的對象

3.  研究細胞壁的發生過程

4.  篩選突變體

5.  膜的結構、運輸、激素接受位點等的研究

6.  用于分離細胞器和大分子

7.  種質資源保存

二、原生質體分離、純化
原生質體分離的最基本原則是保證原生質體不受傷害及不損害它的再生能力。
1.  分離方法
（1）機械法分離：缺點：產量極低；應用的材料受限制；操作極費力

（2）酶法分離：Cocking最早開展這方面研究，克服了機械法分離的缺陷，可分為直接法和順序法兩種。酶法可在短時間內獲得大量原生質體，缺點是：不純的酶制劑所含雜質對原生質體可能有不同程度的毒害作用。

2.  影響原生質體分離的因素（酶法）
從理論上講，只要用適當的酶處理，就能從任何活組織中分離得到原生質體。但是對于原生質體培養來說，要得到活性高、能進行分裂、形成愈傷組織、最后再生完整植株的原生質體則受許多因素的影響。

3. 原生質體分離時主要應考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等。
（1）外植體來源：生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質體的關鍵，并影響著原生質體的復壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。用于原生質體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養物（Suspension cultures）、原球莖、花瓣和葉表皮等。葉肉細胞是常用的材料，葉片很易獲得而且能充分供應。取材時，一般用剛展開的幼嫩葉片。另一個分離原生質體的常用材料是愈傷組織或懸浮細胞，采用其作材料可以避免植株生長環境的不良影響，可以常年供應，易于控制新生細胞的年齡，處理時操作方便，無需消毒。選用懸浮細胞作材料時，需每隔3-5天繼代一次，培養一段時間使細胞處于旺盛生長狀態。一般在繼代后的第三天游離原生質體。

（2）酶液組成和濃度
植物細胞壁由三個主要成分構成：纖維素，壁干重的25-50%，半纖維素，平均53%，果膠質，5%用來分離植物原生質體的酶制劑主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶等，酶解花粉母細胞和四分體小孢子時還要加入蝸牛酶。纖維素酶的作用是降解構成細胞壁的纖維素，果膠酶的作用是降解連結細胞的中膠層，使細胞從組織中分開，以及細胞與細胞分開。

常用的酶制劑有：纖維素酶有Cellulase Onozuka R-10，Cellulase Onozuka RS，Cellulase。果膠酶有Pectolyase Y23，Macerozyme，Pectinase等。半纖維素酶有Rhozyme Hp-150，大多數植物分離原生質體時，纖維素酶濃度在1%-3%，果膠酶在0.1%-1%，但也有很多例外。

（3）滲透壓：原生質體操作需要在一定滲透壓存在下進行，常用的配制分離原生質體酶液的溶液以及洗滌原生質體的溶液為CPW液，CPW鹽成分為：

根據滲透劑的濃度和成分可分為以下幾種培養基：
CPW13M：CPW鹽+13%甘露醇（mannitol）
CPW9M：CPW鹽+9%甘露醇
CPW21S：CPW鹽+21%sucrose
CPW0M：CPW鹽溶液。
多數情況下，甘露醇是常用的滲透劑，可能是由于它的鈍性及擴散入原生質體的速度很慢的緣故，這樣一來能保證一個穩定的滲透壓。

（4）分離培養基：鈣、鎂離子很重要，有時需要激素，PVP有時能增加原生質體產量。分離原生質體的培養基用量一般為10 mg/g 組織。

（5）培養條件：主要的是酶處理時的溫度和pH。不同的酶需要的pH值不一樣，但pH大于6時不利于原生質體生存。一般而言，分離原生質體的培養時間與溫度成反比，可是高溫下短時間分離的原生質體不適于培養，他們易發褐和破裂。但酶處理時間一般不超過24小時。一般常用溫度是23-32℃。酶處理時一般在暗處培養。葉片分離原生質體可在靜置條件下進行，懸浮細胞由于壁厚，培養（分離）過程中間斷低速震蕩有利于酶滲透。

（6）組織前處理：主要目的是便于原生質體分離和促進細胞分裂。高滲前處理；激素處理 ；低溫處理；激素處理與低溫處理結合使用。

3.  原生質體的收集、純化與活力測定
經酶解處理后，得到的混合物是一個由原生質體、細胞團與細胞碎片等組成的混合液，只有將雜質和酶液去掉，使原生質體純化，才能進行培養。
（1）收集：原生質體混合液用濾網（40-100 μm）去掉沒有降解的細胞及組織，收集濾液。

（2）洗滌：將網下物低速離心，去掉上清液,再加無酶液的CPW液懸起原生質體，再離心，棄上清，重復幾次即可。

（3）純化：采用上浮法和下沉法兩種純化方法。上浮法是將酶解的原生質體與蔗糖溶液（23%左右）混合，下沉法是先將原生質體與13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液頂部，形成一個界面。兩種方法中，均在100×g 下離心5-10分鐘，會在蔗糖溶液頂部形成一條原生質體帶。用吸管將帶輕輕地吸出來，用培養基懸浮離心，然后稀釋到104-105個/ml，用于培養。

（4）活力測定：原生質體培養前通常要進行活力檢查，以便知道其狀態是否正常。測定原生質體活力的方法主要有觀察胞質環流（Cytoplasmic streaming）、測定呼吸強度和FDA染色，其中最常用的是FDA法。FDA是熒光素雙醋酸酯（Fluorescein diacetate，FDA），常用丙酮配置成2 mg/ml 溶液，在冰箱（4°C）中保存。FDA本身沒有極性，無熒光，可以穿過細胞膜自由出入細胞，在細胞中不能積累。在活細胞中，FDA經酯酶分解為熒光素，后者為具有熒光的極性物質，不能自由出入細胞膜，從而在細胞中積累。在紫外光照射下，發出綠色熒光。相反如果是死細胞，則不會發出綠色熒光。

三、原生質體培養
1.  原生質體計數
原生質體培養前必須調到一定密度，即確定每毫升培養基中含多少原生質體。用CPW13M懸浮原生質體，血球計數板計數，計算稀釋倍數，離心，去除CPW13M，用所算體積的培養基懸起原生質體，用于培養。

2.  原生質體培養
 
（1）液體淺層培養（Liquid thin layer culture） 
  原生質體純化后，將原生質體懸浮于液體培養基中，取少許于培養皿底部形成很薄的一層，封口進行培養。 

（2）固體培養（Solid culture） 
也叫瓊脂糖平板法（Agarose plate culture）或包埋培養法（Embedding culture）。將原生質體懸浮于液體培養基后，與凝固劑（主要是瓊脂或低熔點瓊脂糖，LMT agarose）按一定比例混合，在培養皿底部形成一薄層，凝固后封口培養。

（3）固液雙層培養法（Solid over liquid culture） 
此法結合液體淺層培養和固體培養的優點，在培養皿底部先鋪一層固體培養基，待凝固后再在其上進行液體淺層培養。固體培養基中的營養成分可以被液體層中的原生質體吸收利用，而原生質體產生的有毒物質可以被固體培養基吸收。
植板率（Plating efficiency，即形成愈傷組織的原生質體數量占所培養原生質體總數的百分比）。

3.  細胞再生
（1）細胞壁的形成：原生質體培養后經過一段時間會再生出細胞壁，原生質體在培養初期仍然為圓球形，隨著培養時間的延長，逐漸變為橢圓形，此時表明已經開始再生細胞壁。不同植物原生質體培養再生細胞壁所需時間不一樣，從幾小時到幾天。簡單的鑒別壁的再生的方法是用熒光增白劑（Calcofouor White），專染纖維素，在熒光燈下發出熒光。

一些因素影響壁的再生：
①碳源；

②培養條件——固體培養時細胞壁再生比液體培養時快；

③滲透劑的種類。

（2）細胞分裂：第一次分裂通常發生在培養后2-5天，可在黑麥中需14天。

4.  植株再生：具有再生能力的原生質體就會不斷分裂，形成多細胞團。當細胞團進一步發育成為肉眼可見的小愈傷組織（Minicallus），要及時轉移到分化培養基（Differentiation medium）中，培養與再生過程同一般的愈傷組織培養。

四、影響原生質體細胞分裂的因素
1.  物理條件
（1）密度: 低于一定密度不能分裂，一般培養密度為：5×10³~5×10⁵/ml。

（2）光：一般原生質體首先在暗處培養一周利于壁形成和細胞再生。照光如何、什么時候照光、光強如何等，直接影響著植板率。

（3）溫度：通常22-25℃。

2.  化學因素
（1）培養基：即使來源于同一種基因型的原生質體，在不同培養基中的再生能力也不一樣。許智宏等（1982，1984）發現在形成細胞團的數量上，KM5P和KM5都不如B5P培養基，但對細胞的持續分裂來說，KM5P和KM5又優于B5P培養基。培養基中的附加物質也會影響到原生質體培養效果，如培養基中的激素、無機鹽組成、氨基酸、有機酸等。MS鐵鹽一般對原生質體培養是有害的，50 μM 較合適，因為高鐵能降低培養基的pH。

常用的KM8P培養基含有豐富的有機成分，包括維生素、AA、有機酸、核苷酸、糖及糖醇等，已經證實有機酸（丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸）可以提高煙草原生質體的植板率。一些研究證明多胺類物質對原生質體發育有影響，培養基中添加腐胺、精胺、亞精胺及精氨酸可以促進巴旦杏原生質體發生分裂。生長素的使用量一定要小心確定，因為它很易使液泡長大或增加新液泡，從而使細胞破裂。

（2）滲透壓調節劑：培養的原生質體隨發育進程需要不斷降低滲透壓，以促進細胞分裂。 原生質體培養基中，以蔗糖和果糖作碳源和滲透壓穩定劑時，細胞不能持續分裂，而用葡萄糖時，原生質體能持續分裂并形成細胞團。現在一個趨勢是將蔗糖或葡萄糖單獨使用或與甘露醇結合作為穩定劑，一旦糖被降解，培養基滲透壓降低，很利于細胞分裂。

3.  原生質體來源 ：分離原生質體所用外植體的生理狀態與原生質體的質量和其后的分裂頻率有著密切的關系。如在小麥原生質體培養中，3-6月齡的懸浮細胞系分離的原生質體分裂率比1月齡的原生質體高。 

4.  基因型：基因型與原生質體培養及形態分化有一定的關系，同一植物不同基因型的原生質體脫分化與再分化所要求的條件不一樣，造成不同品種在相同條件下的再生能力也會不同。 

5.  微電流處理：已經發現微電流處理能夠促進三葉草、白芷、石防風、梨屬、李屬、大豆屬和茄屬植物原生質體細胞壁再生，提高分裂頻率，促進細胞團的形成。