PDL1+CTEC及CTC在肺癌NSCLC中的不同重要臨床意義

　　 免疫治療近年來已成為腫瘤治療的重要手段, 然而目前只有30% 的肺癌病人治療效果顯著(ASCO 2019)。因此，有效檢測并揭示對免疫治療耐藥的相關細胞具有非常迫切的重要意義。當人們的目光還在聚焦于CTC的同時，“細胞型循環腫瘤標志物”的另一重要組成部分 — “異倍體循環腫瘤血管內皮細胞CTEC”已開始進入人們的視野。

　　最近，首都醫科大學附屬北京胸科醫院、北京大學腫瘤中心/北京腫瘤醫院消化道腫瘤內科重點實驗室及賽特生物密切合作，應用賽特SE-i·FISH? 技術對接受二線O 藥(opdivo, nivolumab)免疫治療的晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者體內PD-L1+ CTC及CTEC進行了聯合檢測與深入研究。本研究在國際上首次報道了外周血中PD-L1+ 異倍體CTEC 的存在，并發現PD-L1+ CTEC對免疫治療具有耐藥特性，且與患者的PFS密切相關。相關成果剛剛發表在《Cancer Letters 》雜志 (影響因子 IF=6.508)。文章第一作者為北京胸科醫院張麗娜、張新勇，通訊作者為賽特生物林平博士，北京胸科醫院李偉英主任為共同通訊作者。

　　本文要點

　　* 應用SE-i·FISH? ，在治療前44%組織標本hPD-L1 -的NSCLC患者體內，可有效檢測出PD-L1+ CTC

　　* CTC及CTEC在免疫治療后會發生蛋白表型、細胞形態、及染色體核型的轉換(post-therapeutic karyotype shifting)，形成對治療耐藥的不同亞類細胞

　　* 與CTC不同，PD患者的CTEC總數及PD-L1+ CTEC亞類細胞數目顯著增加

　　* PD-L1+ CTEC 具有對免疫治療O藥耐藥特性。其中，多倍體(≥4 倍體) PD-L1+ CTEC具有“內源性耐藥”特性，而三倍體PD-L1+ CTEC則呈現“誘發性耐藥”特性

　　* 含有8號染色體多倍體PD-L1+ CTEC的NSCLC PD患者，無進展生存期 (PFS) 明顯縮短

　　* 本實驗對研究腫瘤免疫治療耐藥具有重要意義

　　腫瘤微環境

　　腫瘤細胞、異倍體腫瘤血管內皮細胞(tumor endothelial cell, TEC)及免疫淋巴細胞是“腫瘤微環境”的重要組成成分。腫瘤微環境中，腫瘤血管內皮細胞TEC增生，可阻礙血液中的淋巴細胞自血液外滲出血管并向腫瘤輸送，進而影響對腫瘤細胞的殺傷作用；而腫瘤細胞又可通過其PD-L1分子與T淋巴細胞上的PD-1 相結合，從而封閉淋巴細胞對腫瘤的殺傷功能。現已證實，部分TEC可脫落入血，形成“異倍體循環腫瘤血管內皮細胞CTEC” (Lin et al., 2017 Sci Rep 7:9789)，其數量變化可反映腫瘤血管的增生情況。

　　腫瘤聯合治療過程中同步檢測CTC與CTEC

　　抗血管生成是臨床治療腫瘤的主要手段之一，然而單純抗血管生成治療可誘導腫瘤細胞高表達PD-L1，進而抑制淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用(Campesato et al., 2017 Ann Transl Med 5:497)。聯合使用抗血管生成與抗PD-1或抗PD-L1治療，有可能會獲得更佳的治療效果。這一點最近已在乳腺癌及胰腺癌腫瘤動物模型上得到了證實(Allen et al., 2017 Sci Transl Med 9:385)。

　　將腫瘤微環境中的腫瘤細胞 、TEC及免疫淋巴細胞三者統籌兼顧的聯合治療（腫瘤免疫治療+抗血管生成）已成為腫瘤治療的重要手段。然而腫瘤的高度異質性造成了聯合治療的效果會因瘤種不同及患者個體不同而有很大差異。因此精準治療顯得尤為重要，而精準治療的首要前提是必須具備“個體化精準檢測”的有效實驗手段。如何同時評估免疫治療和抗血管生成藥物的療效是目前困擾臨床的最大問題。因缺乏相關檢測技術手段，迄今為止國內外沒有任何相關研究報道。本課題應用SE-i·FISH?技術同步聯合檢測PD-L1+ CTC與CTEC，并在分子水平探究其對免疫治療敏感和耐藥特性，取得的重要成果在國際上填補了此領域的空白。

　　為了準確篩選適于免疫治療的腫瘤患者、有效制定個體化治療方案、以及全面客觀評估腫瘤免疫治療或聯合其它治療手段的療效 (包括放化療、靶向、介入、抗血管生成等)，相關液體活檢已不應該再局限于以往單一的PD-L1+ CTC檢測，而是將PD-L1+ CTC與PD-L1+ CTEC 進行聯合檢測與綜合考量，這將為人們在腫瘤防治及研究等領域提供全新的視角以及更加完整、客觀的實時性檢測結果。

　　6-通道SE-i·FISH? 同步原位檢測Vimentin+ 及PD-L1+ CTCs 與CTECs

　　與PD-L1分布在HepG2肝癌細胞膜表面不同，NSCLC肺癌細胞A549中的PD-L1主要表達在細胞核內或核膜上 (nuclear nPD-L1)。細胞內不同部位的PD-L1具有不同的生物學功能與臨床意義，例如，NSCLC腫瘤細胞上的PD-L1表達與腫瘤細胞的間質化表型(Vimentin+) 密切相關 (Kowantez et al., 2018 PNAS 115:E10119)，PD-L1向核內的轉運與Vimentin的表達及PI3K/AKT信號傳導通路相關。nPD-L1+ 的結直腸癌及前列腺癌患者，其PFS及OS明顯縮短 (Satelli, et al., 2016 Sci Rep 6:28910)。

　　臨床實驗數據分析 ：多倍體PD-L1+ CTEC亞類細胞具有對免疫治療耐藥的特性

　　動態監測CTC、CTEC案例報道：1）患者P1 接受O藥治療至第8療程時進展為PD，并伴有肺癌遠端骨轉移。此時，多倍體大細胞CTC及CTEC 數目均有很大增加，且PD-L1+ CTEC的比例增加；2）患者P5治療至第9個療程時呈現PD，原發灶顯著增大，但無遠端轉移。患者CTEC數目降低，Vim+CTC及CTEC消失，PD-L1+ CTC消失，但PD-L1+ CTEC的比例顯著增高，患者在從第8程至第9程發生PD的過程中，大細胞CTC數目增多；3）患者P2治療至第12療程時仍為SD，可見CTC及CTEC數目降低，PD-L1+ CTC消失，但仍檢測出Vim+ CTEC，14療程時患者呈現PD，此時CTC及CTEC總數增加，并伴有PD-L1+ CTEC 及PD-L1+ CTC 出現。

　　群體臨床數據分析發現，二線O藥治療后的PD 病人，CTEC總數顯著上升。“治療后核型轉換”分析(post-therapeutic karyotype shifting)顯示，免疫治療后進展為PD的患者體內8號染色體多倍體(≥4倍體)大細胞 CTEC比例高達81%，較治療前增加了近一倍。通過桑基圖 (Sankey Diagram) “細胞流向分布”可見，PD患者體內增加的CTEC主要是PD-L1+ CTEC亞類細胞，而這些患者的CTC通常呈現PD-L1 -。

　　免疫治療后的PD患者中，雖然PD-L1+ CTC仍然可以得到有效控制，由治療前的PD-L1+ CTC 4人降低為PD時的1人，但檢測出PD-L1+ CTEC的患者則由療前1人增加為PD時的7人。熱圖分析顯示，PD-L1+ CTC主要見于治療前hPD-L1+ 患者，而PD-L1+ CTEC則主要在hPD-L1 -患者接受O藥治療后出現。

　　PD患者體內出現的PD-L1+ CTEC，主要由治療前就已存在的多倍體大細胞CTEC (69%) 和免疫治療后才出現的三倍體CTEC (31%)組成。因此，PD-L1+ 多倍體CTEC 具有“內源性免疫治療耐藥”特性，而PD-L1+ 三倍體CTEC具有“誘發性免疫治療耐藥”特性。由此可見，二線免疫治療引起PD-L1+ CTEC的“治療后核型轉換”與腫瘤產生誘發性免疫治療耐藥相關。

　　PD-L1+ CTEC 與PFS密切相關

　　腫瘤進展后的PD患者體內無論是否含有PD-L1+ CTC，其PFS無顯著性差異；但含有PD-L1+ CTEC的患者，其PFS顯著縮短。由此可見，多倍體PD-L1+ CTEC與腫瘤進展密切相關。

　　CTEC 檢測的特殊臨床意義

　　本研究發現，PD的腫瘤患者伴有CTEC總數和PD-L1+ CTEC 亞類數目的增加，患者此時的腫瘤血管內皮TEC增生，阻礙血液中的淋巴細胞外滲出血管向腫瘤輸送；同時TEC及CTEC上的PD-L1又可與T淋巴細胞上的PD-1相結合 ，從而進一步抑制淋巴細胞對腫瘤細胞的免疫殺傷作用。而PD-L1+ CTC數量在患者PD時并無升高，提示PD-L1+ CTEC 與PD-L1+ CTC對anti-PD-1免疫治療具有不同的應答機理與療效。二線O 藥可能無法有效阻斷T淋巴細胞上的PD-1 與CTEC上的PD-L1相結合，或無法促進T 細胞消除PD-L1+ CTEC，從而最終導致腫瘤進展 (PD)。

　　CTC與CTEC兩者間不僅能夠相互協調，而且可以相互融合，形成異倍體“腫瘤上皮-腫瘤血管內皮”融合細胞團。與EMT過程相似，此融合細胞團可通過EndoMT表現為Vimentin+ 間質型 (Lin et al., 2017 Sci Rep 7:9789)，或是本文報道的Vim -非間質型。

　　除了PD-L1、Vimentin以外，我們已證實異倍體CTEC還可表達其它多種腫瘤標志物，如HER2, EpCAM 及干細胞標志物 CD44v6 等。深入開展后續相關研究，將有助于人們進一步闡明“細胞型循環腫瘤標志物”CTC與CTEC (尤其是那些表達了腫瘤標志物的CTEC、融合細胞團等) 是如何在腫瘤寡轉移和遠端廣泛轉移過程中相互協調并發揮重要作用的 (Zhao et al., 2019 Semin Cancer Biol, in press)。此外，國際上已有報道指出，異倍體染色體數目的多少與腫瘤的惡性度成正比。染色體異常拷貝數越高，腫瘤惡性度越高 (Kronenwett et al., 2004 Cancer Res 64:904)。CTC及CTEC中的染色體異常拷貝數與腫瘤進展、耐藥、轉移、復發等的關聯性顯然也是今后值得密切關注的新領域。

　　結 論

　　* 本實驗建立了如何利用SE-i·FISH? 同步、原位聯合檢測PD-L1+ CTEC與CTC的完整實驗體系與思路（包括實驗設計、數據采集、從個例到群體的結果分析方法、相關臨床意義的探討等），為今后開展不同瘤種的大規模臨床實驗奠定了基礎

　　* 針對CTC及CTEC的不同臨床意義，本研究已不再局限于單一的細胞計數，而是圍繞細胞生物鏈三要素 (腫瘤標志物蛋白表型、染色體核型及細胞形態) 在分子水平上開展三位一體的全方位綜合性檢測CTC與CTEC (Lin 2018 Diagnostics (Basel) 8:26)，從而為廣大醫生提供更加全面、準確、客觀的腫瘤治療全程實時信息

　　* PD-L1+ CTEC 與PD-L1+ CTC對anti-PD-1免疫治療具有不同的應答機理與療效

　　* 異倍體CTC 與CTEC共同構成了具有生物活性的、實時性“細胞型循環腫瘤標志物”，具有伴隨腫瘤進展的完整核酸與蛋白信息含量，兩類細胞相輔相成、相互作用，在腫瘤的發生、進展、轉移、耐藥、復發等過程中發揮著關鍵作用

　　* 動態聯合監測異倍體PD-L1+ CTC及PD-L1+ CTEC 可實時評估單一治療或聯合治療腫瘤的療效，并能鎖定對治療敏感或耐藥的不同CTC 或CTEC亞類細胞，從而為篩選適于接受免疫治療的腫瘤患者、制定個體化精準治療方案、提高腫瘤治療療效以及開展后續單細胞分析、抗腫瘤新藥研發等提供積極指導意義