PCR污染與對策

PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生.

一、污染原因

1、標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染.

2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.

3、PCR擴增產物污染.這是PCR反應中最主要最常見的污染問題.因為PCR產物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性.

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.

4、實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見.因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大.

二、污染的監測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.

對照試驗

1.陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志.陽性 對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽 性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下).

但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽 性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經自己使用穩 定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照.

2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照.它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照.②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染.

3.重復性試驗

4.選擇不同區域的引物進行PCR擴增

三、防止污染的方法

1、污染的預防

進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。

（1）劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：

a）標本處理區，包括擴增摸板的制備；

b）PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增；

c）產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。

各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。

切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。

2、分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：

a）PCR用水應為高壓的雙蒸水；

b）引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制；

c）引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。

3、實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：

（1）戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

（2）使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

（3）避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

（4）操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；

（5）最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；

（6）操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；

（7）盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；

（8）重復實驗，驗證結果，慎下結論。

四、追蹤污染源

如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。

1、設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。

2、環境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。

環境污染中常見的污染源主要有：

（1）模板提取時真空抽干裝置；

（2）凝膠電泳加樣器；

（3）電泳裝置；

（4）紫外分析儀；

（5）切膠用刀或手術刀片；

（6）離心機；

（7）冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等；

此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結果。

（8）氣溶膠。如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的，此時就應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。

（1）戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

（2）使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

（3）避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

（4）操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；

（5）最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；

（6）操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；

（7）盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；

（8）重復實驗，驗證結果，慎下結論。

四、追蹤污染源

如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。

1、設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。

2、環境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。

環境污染中常見的污染源主要有：

（1）模板提取時真空抽干裝置；

（2）凝膠電泳加樣器；

（3）電泳裝置；

（4）紫外分析儀；

（5）切膠用刀或手術刀片；

（6）離心機；

（7）冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等；

此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結果。

（8）氣溶膠。如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的，此時就應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。