棉花干旱抗逆脅迫新基因表達及特征分析

干旱等非生物脅迫因素導致作物在形態、生理、生物化學及細胞水平上產生一些不利于其生長的反應，嚴重地阻礙著現代農業的發展。隨著全球氣候變暖和人類活動加劇，干旱有明顯加重的趨勢。棉花生產是紡織工業及國防建設的重要物質基礎，也是中國農業重要組成部分，對中國國民經濟的發展有著重要的影響，而且在世界棉花貿易市場上也起著舉足輕重的作用。但是，每年由于旱災引起的棉花年減產量達總量的 30% 以上，干旱已經成為限制棉花生產的首要非生物因素，實踐證明采用傳統的育種手段很難解決這一問題，因此，克隆抗旱基因并采用基因工程的方法培育抗旱新品種具有十分重要的意義。

MYB 轉錄因子廣泛的分布于植物、動物和真菌中，第一個被鑒定出來的 MYB 轉錄因子與細胞周期相關，MYB 家族成員眾多，與次級代謝的調節、細胞形態控制、細胞周期及信號轉導等有關植物 MYB 類轉錄因子是轉錄因子最大家族之一，以含有 MYB 結構域為共同特征。棉花是較為耐旱的作物，其基因組中可能蘊藏著大量與抗旱相關的基因，但由于棉花基因組較為復雜，對耐旱基因的挖掘較少，棉花抗旱的機理尚不清楚，需要進行深入的研究。

中國農業科學院棉花研究所立題《一個亞洲棉 MYB 家族新基因的克隆及特征分析》，該研究克隆了亞洲棉 MYB 家族的一個新基因，通過對其序列及其響應 PEG6000 脅迫表達規律的分析，為進一步研究其功能，探索亞洲棉 MYB 家族基因的抗旱機制奠定基礎。

模擬干旱條件下 GaMYB2 基因的表達分析

為了研究 GaMYB2 在亞洲棉石系亞 1 號中的抗旱表達特征，提取經 17% PEG6000 處理不同時間的 3 葉期幼苗根部進行 Real-time PCR 檢測（圖8）。從圖中可以看到，脅迫處理后 GaMYB2 的相對表達量較對照（0 h）有明顯的提高，在 3 h 時根部基因的表達量顯著提高，并達到最大，此后表達量逐漸回落，結果表明，GaMYB2 響應 PEG6000 模擬的干旱脅迫，可能參與干旱脅迫防御反應。

GaMYB2 基因通過基因槍法轉化洋蔥表皮細胞瞬時表達分析

分別用 70% 乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉（直徑為 1 μm），加入滅菌蒸餾水制成金粉懸浮液，取 100 μL 放在含有 1.0 cm² 洋蔥表皮的玻璃皿中，邊振蕩邊加入 10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP 質粒，逐步加入 40 μL 0.1 mol·L-1 亞精胺和 100 μL 2.5 mol·L-1 CaCl₂，振蕩混勻。基因槍 GDS-80（購自美國 Wealtec corp）轟擊時氦氣罐的氣壓為 1300 psi，取 10 μL DNA 包裹好的微粒懸浮液加到基因槍中央，進行轟擊，之后放置 25 ℃ 避光過夜培養，使用 ConfocalLaser 激光共聚焦顯微鏡觀察。

采用基因槍轟擊的方法，用包裹質粒的金粉對洋蔥表皮進行轟擊，暗培養過夜后，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察（圖10），從圖10-A 中可以看出對照GFP空載體在整個洋蔥細胞均能看到綠色熒光，為組成型表達；從圖10-B 中發現 GaMYB2-GFP 的融合表達載體只能在細胞核中能看到綠色熒光，這進一步證明該蛋白不具有跨膜蛋白結構，定位在細胞核中，具有轉錄因子的一般特征。

討論

干旱、鹽堿、低溫等環境脅迫對植物的生長和種子的形成產生了不利的影響，植物通過一系列的生化和生理過程來適應這些脅迫。MYB 轉錄因子是植物中最大的轉錄家族之一，在擬南芥中已經鑒定出 198 個 MYB 家族的成員，其中一些成員如 AtMYB44、AtMYB60 及 AtMYB61 通過調控氣孔的開閉幫助植物體應對干旱脅迫。

通過超表達 MYB 基因的試驗發現，陽性植株的干旱耐受能力顯著提高，這預示著 MYB 家族成員在改良作物抗旱方面具有很大的潛力。雖然關于 MYB 類基因調控抗旱作用機制的細節還不很清晰，但是，已經取得了不少進展，一般認為 MYB 轉錄因子位于 ABA 信號通路的下游，植物在受到干旱脅迫時，MYB 與 MYBR（受體）結合，激活 RNA 聚合酶 Ⅱ 轉錄復合物，從而直接啟動調控靶基因的表達，最后通過基因產物對內外信號做出調節反應，最終引起一些生理生化反應來保護自身。植物根部特征與植物的抗/耐干旱性密切相關，根系的形成主要受土壤水分含量的影響，一般主根的生長不受水分脅迫的影響，側根的數目受其影響較大。MYB96 能夠在干旱脅迫時調節 ABA 信號通路，使擬南芥的根系更加發達，這將有利于擬南芥在干旱脅迫時攝取更多的水分，達到保護自身的目的。

根組織不僅是接受干旱脅迫信號的主要位點，也是調控植物抗/耐干旱能力的關鍵部位。雖然嚴重的旱脅迫情況下，棉花的生長及種子的形成都會受到嚴重影響，但棉花還是較為耐旱的作物。為了尋找棉花抗干旱相關的關鍵基因，中國農業科學院棉花研究所轉基因實驗室對 PEG6000 脅迫處理亞洲棉的根組織材料進行了 RNA 測序分析，GaMYB2 是從 RNA 數據中挑選一個上調表達的基因，Real-time PCR 結果進一步表明 GaMYB2 在根中表達量最高，這說明該基因可能在根部的生長和發育及其生理活動中發揮重要作用。GaMYB2 可能是棉花抗旱能力改良的重要候選基因，但是 GaMYB2 是否真正參與植物體干旱耐受能力的調控及其調控機理如何還有待進一步的試驗研究。 

結論

從亞洲棉中克隆出 MYB 家族的一個新基因 GaMYB2， cDNA 全長 1 117 bp，ORF 長 840 bp，編碼 279 個氨基酸，GaMYB2 蛋白具有 R2R3 型 MYB 蛋白的一般特征。利用第三代低壓手持式基因槍 GDS-80 快速驗證了該基因在細胞核中表達，并且在根部和花中表達量較高。經 PEG6000 脅迫后，其表達量上調表達，3 h 達到最高，因此，亞洲棉受到干旱脅迫時根部該基因的表達量增加對抵御外界的干旱環境可能發揮一定作用。

參考資料

楊召恩, 楊作仁, 劉坤,等. 一個亞洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析[J]. 中國農業科學, 2013, 46(1):195-204.