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熒光光度計主要原理依據是：激發光照射待測熒光物質發出熒光，經過放大器至記錄儀，記錄儀得出的信號即為樣品溶液的熒光強度。本文主要介紹了RF-5301PC型熒光分光光度計 的工作原理、操作規程以及注意事項等。
儀器設備 編號、名稱
儀器設備 名稱：熒光分光光度計
型 號：RF-5301PC型
國 別 廠 家：日本島津公司
工作原理
熒光產生的原理
熒光的定義：某些物質受紫外光或可見光照射激發后能發射出比激發光波長較長的光。
熒光產生的原理：化學物質能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學能等)而進入激發態，當其從激發態再回復到基態時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發光)。
1. 熒光激發光譜，就是通過測量熒光體的發光通量隨波長變化而獲得的光譜，它反映了不同波長激發光引起熒光的相對效率。
2. 熒光發射光譜，如使激發光的波長和強度保持不變，而讓熒光物質所產生 的熒光通過發射單色器后照射于檢測器上，掃描發射單色器并檢測各種波長下相應的熒光強度，然后通過記錄儀記錄熒光強度對發射波長的關系曲線，所得到的譜圖稱為熒光光譜。
物質的激發光譜和熒光發射光譜，可以用作該物質的定性分析。當激發光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度范圍內，其發射光強度與溶液中該物質的濃度成正比關系，可以用作定量分析。
熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有“自熄滅”作用，以及由于在液面附近溶液會吸收激發光，使發射光強度下降，導致發射光強度與濃度不成正比，故熒光分析法應在低濃度溶液中進行。
熒光發射的特點：可產生熒光的分子 或原子在接受能量后即刻引起發光;而一旦停止供能，發光(熒光)現象也隨之在瞬間內消失。
溶液熒光光譜通常具有的特征：
(1) 斯托克斯位移：在溶液熒光光譜中，所觀察到的熒光的波長總是大于激發光的波長。
(2) 熒光發射光譜的形狀與激發波長無關。
(3) 熒光發射光譜的形成與吸收光譜的形狀有鏡像關系
熒光的猝滅：熒光分子 的輻射能力在受到激發光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅 ，這是由于激發態分子的電子不能回復到基態，所吸收的能量無法以熒光的形式發射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質的保存應注意避免光(特別是紫外光)的直接照射和與其他化合物的接觸。
熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發射熒光光量子的數值成正比。
熒光效率=發射熒光的光量分子數(熒光強度)/吸收光的光量子數(激發光強度)
發射熒光的光量子數亦即熒光強度，除受激發光強度影響外，也與激發光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發射光譜(熒光光譜)，即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發射峰。選擇激發光波長量接近于熒光分子的最大吸收峰波長，且測定光波量接近于最大發射光波峰時，得到的熒光強度也最大。
測量原理
稀溶液 IF=2.303φFI0εc b,
其中，I0為激發光強度;If為熒光強度;
φf為熒光效率; b為液池厚度;
ε和c分別為發光物質的摩爾吸光系數和摩爾濃度。
技術指標：
波長掃描范圍：220-900nm
波長精度：±1.5nm;
狹縫范圍：0.15-20nm
信噪比：S/N比150以上(水拉曼峰測定，狹縫5nm)
最高掃描速度：5，500nm/min
操作規程
1. 開機
a. 確認所測試樣液體或固體，選擇相應的附件。
b. 先開啟儀器主機電源，預熱半小時后啟動電腦程序RF-530XPC，儀器自檢通過后，即可正常使用。
2. 測樣
(1) spectrum模式
a. 在“Acquire Mode”中選擇“Spectrum”模式。
· 對于做熒光光譜的樣品，“Configure”中“Parameters”的參數設置如下：
“Spectrum Type”中選擇Emission;給定EX波長;給定EM的掃描范圍(最大范圍220nm—900nm);設定掃描速度;掃描間隔;狹縫寬度，點擊“OK”完成參數的設定。
· 對于做激發光譜的樣品，“Configure”中“Parameters”的參數設置如下：
“Spectrum Type”中選擇Excitation;給定EM波長;給定EX的掃描范圍(最大范圍220nm—900nm);設定掃描速度;掃描間隔;狹縫寬度，點擊“OK”，完成參數的設定。
b. 在樣品池中放入待測的溶液，點擊“Start”，即可開始掃描。
c. 掃描結束后，系統提示保存文件。可在“Presentation”中選擇“Graf” “Radar” “Both Axes Ctrl+R”來調整顯示結果范圍;在“Manipulate” 中選擇“Peak Pick”來標出峰位，最后在“Channel”中進行通道設定。
d. 述操作步驟對固體樣品同樣適用。
(2) Quantitative模式
a. 在“Acquire Mode”中選擇“Quantitative”模式。
b. “Configure”中“Parameters”的參數設置如下：
Method 選擇“Multi Point Working Curve” ;“Order of Curve” 中選擇 “1st和“No” ;給定EX、EM波長;設定狹縫寬度，點擊“OK”，完成參數的設定。
c. 在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執行“Auto Zero” 命令校零點。
d. 點擊“Standard”模式，制作工作曲線。
e. 將樣品池中的空白溶液換成一系列的已知濃度的樣品標準溶液進行測量，執行“Read”命令，得到相應的熒光強度，系統根據測量值自動生成一條“熒光強度-濃度”曲線。
f. 在“Presentation” 中選擇“Display Equation”，得到標準方程。將此工作曲線 “Save”為擴展名為“.std”的文件。
g. 工作曲線制備完畢，即可進入未知樣的測量，選擇進入“Unknown”模式，將樣品池中的已知濃度標準溶液換成待測樣品溶液，執行“Read”命令，即可得到相應的熒光強度和相應的濃度。將此 “Save”為擴展名為“.qnt”的文件。
(3) Time Course模式
a.