27篇SNC論文！他憑這些學術成就獲億元融資

　　基因修飾動物是研究在發育和疾病中基因功能的重要工具。CRISPR/Cas9系統有效的應用于構建基因敲除和敲入小鼠。而楊輝團隊正好專注于該領域。

　　楊輝，30歲時，就成為中科院上海生科院神經所研究員；2015年，入選國家“青年千人計劃”；2019年，楊輝博士獲得國家杰出青年基金資助。

　　由楊輝創辦的輝大（上海）生物科技有限公司（簡稱輝大基因）宣布完成逾億元人民幣的A輪融資，由辰德資本領投，新投資方藥明康德、惠每資本、雅惠資本以及原有投資方夏爾巴投資四家機構跟投。本輪融資所得將主要用于輝大基因的核心臨床管線的推進，組建研發與臨床前研究團隊以及開展GMP級生產車間的建設。此前，輝大基因曾在2018年11月完成了夏爾巴投資的3000萬元人民幣的天使輪融資。

　　目前楊輝博士已在Science，Nature 、Cell 等頂級期刊上發表近27篇學術論文，iNature在這里系統介紹楊輝的3篇Cell，2篇Nature及1篇Science成果：

　　【1】2019年6月10日，中科院神經科學研究所楊輝、周海波，與四川大學郭帆和中科院上海營養所李亦學共同通訊在Nature在線發表題為“Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis”的研究論文，該研究進一步驗證了BE3與ABE兩種DNA單堿基編輯器在RNA水平上的脫靶現象，提出了針對這兩種系統的優化方案，有效降低了它們在RNA水平上的脫靶效應；

　　【2】2019年2月28日，中國科學院靈長類神經生物學重點實驗室楊輝研究組,上海生科院李亦學及斯坦福大學Lars M. Steinmetz等人在Science發表題為“Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos”的研究論文，該研究建立了一種被命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術，并使用該技術發現: 近年來興起的單堿基編輯技術有可能導致大量無法預測的脫靶，因而存在嚴重的安全風險。此研究顯著提高了基因編輯技術脫靶檢測的敏感性，并且可以在不借助于任何脫靶位點預測技術的情況下發現之前的脫靶檢測手段無法發現的完全隨機的脫靶位點，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業檢測標準；

　　【3】II型細菌CRISPR / Cas系統是一種新型基因組靶向技術，易于多重基因敲除。2013年9月12日，美國Whitehead生物醫學研究所Rudolf Jaenisch團隊（楊輝第一作者）在Cell 在線發表題為“One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering”的研究論文，該研究通過共注射具有Cas9 mRNA和不同sgRNA的受精卵以及不同大小的DNA載體來創建報告基因和條件突變小鼠。使用這種一步法，研究人員在Nanog，Sox2和Oct4以及Mecp2基因條件突變小鼠。此外，使用靶向Mecp2基因中兩個獨立位點的sgRNA，產生了具有約700bp的缺失的小鼠。最后，該研究分析了基因修飾小鼠和ESC系中5種sgRNA的潛在脫靶，并在極少數情況下鑒定了脫靶突變；

　　【4】攜帶多個基因突變的小鼠傳統上通過胚胎干細胞中的連續重組和/或具有單個突變的小鼠的耗時雜交產生。CRISPR / Cas系統被認為是有效的基因靶向技術，具有多重基因組編輯的潛力。2013年5月9日，美國Whitehead生物醫學研究所Rudolf Jaenisch團隊（楊輝共同第一作者）在Cell 在線發表題為“One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering”的研究論文，該研究證明CRISPR / Cas介導的基因編輯允許高效地同時破壞小鼠胚胎干細胞（ES）中的五個基因（Tet1,2,3，Sry，Uty-8等位基因）。將靶向Tet1和Tet2的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中，產生具有雙等位基因突變的小鼠，效率為80％；最后，該研究顯示Cas9 mRNA / sgRNA與突變體寡核苷酸的共注射在兩個靶基因中同時產生精確的點突變。因此，CRISPR / Cas系統允許一步產生攜帶多個基因突變的動物，這種方法將大大加速功能冗余基因的體內研究；

　　【5】2012年4月，徐國良等人（楊輝第一作者）在Cell 在線發表了題為“Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells”的研究論文，該研究首次建立了來自小鼠精子的孤雄單倍體胚胎干細胞，并證明這些細胞能夠代替精子使卵母細胞“受精”產生半克隆小鼠（稱為“半克隆”技術）；

　　【6】2011年9月，徐國良等人（楊輝共同第一作者）在Nature 在線發表了題為“The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes”的研究論文，該研究發現在小鼠受精卵中，5-甲基胞嘧啶（5mC）的氧化發生在父本基因組上，將5mC變為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。此外，該研究還證明雙加氧酶Tet3特別富集在雄性原核中。因此，Tet3介導的DNA羥化作用參與自然受精后合子父本DNA的表觀遺傳重編程，并且還可能有助于動物克隆過程中的體細胞核重編程；

　　1、單堿基編輯技術脫靶現象的驗證及優化

　　最近開發的DNA堿基編輯方法能夠在基因組DNA中直接產生所需的點突變而不產生任何雙鏈斷裂（DSB），但是脫靶編輯的問題限制了這些方法的應用。雖然先前的幾項研究已經評估了基因組DNA中的脫靶突變，但現在認識到常用的DNA堿基編輯器中的脫氨酶通常表現出RNA結合活性。例如，發現胞嘧啶堿基編輯器（CBE）中使用的胞嘧啶脫氨酶APOBEC1靶向DNA和RNA，并且發現腺嘌呤堿基編輯器（ABE）中使用的腺嘌呤脫氨酶TadA誘導RNA上的位點特異性肌苷形成。

　　然而，尚未評估由DNA堿基編輯引起的任何潛在的RNA突變。腺相關病毒是DNA編輯基因療法最常用的傳遞系統；這些病毒可以在體內維持長期基因表達，因此DNA基因編輯誘導的潛在RNA突變的程度非常值得關注。

　　在這里，研究人員定量評估了由CBEs和ABEs誘導的RNA單核苷酸變異（SNV）。研究人員發現胞嘧啶堿基編輯器BE3和腺嘌呤堿基編輯器ABE7.10都產生了數萬個脫靶RNA SNV。隨后，通過工程化脫氨酶，研究人員發現三種CBE變體和一種ABE變體將脫靶RNA SNV降低至基線，同時保持其有效的DNA靶向活性。該研究揭示了DNA編輯中脫靶效應的先前被忽視的方面，并且還證明通過工程脫氨酶可以消除這種效應。值得注意的是，目前的優化方案都不能解決BE3單堿基編輯系統對基因組DNA 上產生的sgRNA序列非依賴性脫靶問題，需要進一步探索新的優化方案解決這一問題。

　　原文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41586-019-1314-0

　　2、楊輝/李亦學/Lars M. Steinmetz等團隊建立新型脫靶檢測技術，基因編輯工具安全性評估或迎來新突破

　　CRISPR/Cas9是廣泛關注的新一代基因編輯工具，自從2012年被發明以來，它一直以其高效性和特異性備受世人的期待，然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問世以來，其脫靶風險一直備受關注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話，脫靶效應可能會引起包括癌癥在內的很多種副作用。

　　在此之前，人們推出過多種檢測脫靶的方案。以前的方法或者依賴于計算機軟件預測，或者依賴于高通量測序檢測DSB產生，還有體外檢測的方法。這些方法都存在一些局限性，不能高靈敏性檢測到脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。因此一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術，將會成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關鍵。人們迫切希望可以找到一種既能夠不依賴于脫靶位點預測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。

　　如果要提升檢測脫靶效應的精度，就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先，為了實現不借助于脫靶位點預測，這就要求必須找到非常嚴格的對照組來確定基因突變的位點；同時為了檢測不依賴于sgRNA的隨機突變，最好使用基于單細胞全基因組測序。

　　為了實現以上目標，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時候，編輯一個卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎發育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細胞，利用流式細胞分選技術基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細胞和沒有基因編輯細胞，再進行全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題。而且由于實驗組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。

　　在楊輝實驗室全體成員與合作單位的共同努力下，GOTI系統被成功建立了起來。團隊成員先用該系統檢測了最經典的CRISPR/Cas9系統，發現設計良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應，這個結果結束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。

　　團隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術BE3，這個系統可以精確引入點突變，在之前的研究中從未發現過有明顯的脫靶問題。然而在GOTI的檢測下發現，BE3存在非常嚴重的脫靶，而且這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點，因此之前方法一直沒有發現其脫靶問題。

　　團隊分析后認為，這些脫靶位點有部分出現在抑癌基因上，因此經典版本的BE3有著很大的隱患，目前不適合作為臨床技術。研究團隊的這些重要發現，證實了以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，也世人重新審視了這些新興技術的風險。

　　更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術，有望由此開發精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業的新標準。

　　參考信息：

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/27/science.aav9973

　　3、通過CRISPR / Cas技術生成攜帶報告基因和條件等位基因的小鼠

　　具有特定基因修飾的小鼠是研究發育和疾病的有價值的工具。胚胎干細胞（ES）中的傳統基因靶向雖然適合于在內源基因中產生復雜的遺傳修飾，但是復雜且耗時。使用直接注射位點特異性核酸酶的DNA或mRNA進入單細胞期胚胎的新方法大大加速了轉基因小鼠和大鼠的生產，產生了特定序列的DNA雙鏈斷裂（DSB），導致靶向突變。共表達與DSB側翼序列同源的單鏈或雙鏈DNA模板可產生具有精確點突變或DNA插入的突變等位基因。最近，將兩對ZFN和兩個雙鏈供體載體原核注射到大鼠受精卵中，產生含有loxP側翼（floxed）等位基因的大鼠。然而，ZFN和雙鏈供體載體的復雜且耗時的設計和產生限制了該方法的應用。

　　CRISPR和Cas蛋白在細菌和古細菌中起基于RNA的適應性免疫系統的作用。II型細菌CRISPR / Cas系統已被證明是有效的基因靶向技術，其促進多重基因靶向。因為Cas9的結合受工程化sgRNA和靶基因組DNA序列之間的簡單堿基對互補性的指導，所以可以通過提供工程化的sgRNA將Cas9導向任何基因組基因座。

　　文章總結

　　以前，研究人員使用II型細菌CRISPR / Cas系統作為有效工具，一步產生攜帶多個基因突變的小鼠）。然而，這項研究留下了許多未解決的問題。例如，闡明了使用CRISPR / Cas基因編輯方法將DNA構建體插入內源基因的效率以及其創建條件性突變小鼠的效用。在這里，研究人員一步生成攜帶三種不同基因的報告基因構建的小鼠以及條件突變小鼠的衍生。此外，研究人員進行了廣泛的脫靶切割分析，并顯示靶向小鼠和源自CRISPR / Cas受精卵注射的ES細胞中的脫靶突變是罕見的。

　　參考信息：

　　http://sci-hub.tw/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23992847

　　4、通過CRISPR / Cas介導的基因組工程一步產生攜帶多基因突變的小鼠

　　轉基因小鼠是了解發育和疾病中基因功能的重要工具。突變小鼠通常通過插入誘變或通過基因靶向方法產生。在常規基因靶向方法中，通過小鼠胚胎干（ES）細胞中的同源重組引入突變。注射到野生型（WT）胚泡中的靶向ES細胞可以促成嵌合動物的種系，產生含有靶向基因修飾的小鼠。生產單基因敲除小鼠是昂貴且耗時的，并且制造雙突變小鼠更是如此。此外，在大多數其他哺乳動物中，沒有可用于嵌合動物的已建立的ES細胞系，這極大地限制了許多物種的遺傳研究。

　　已經開發了替代方法，通過將位點特異性核酸酶的DNA或mRNA直接注射到單細胞胚胎中以在各種物種的特定基因座處產生DNA雙鏈斷裂（DSB）來加速基因組修飾的過程。然后可以通過易錯的非同源末端連接（NHEJ）修復由這些位點特異性核酸酶誘導的DSB，導致突變小鼠和在切割位點攜帶缺失或插入。為了剖析具有冗余功能的基因家族成員的功能或分析遺傳途徑中的上位關系，需要具有兩個或更多個突變基因的小鼠，促使開發用于產生攜帶多個突變基因的動物的有效技術。

　　最近，II型細菌CRISPR / Cas系統已被證明是一種有效的基因靶向技術，具有多重基因組編輯的潛力。細菌和古細菌已經進化出基于RNA的適應性免疫系統，其使用CRISPR和Cas蛋白來檢測和破壞入侵病毒和質粒。Cas蛋白，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）形成核糖核蛋白復合物，其靶向并降解外來核酸。

　　ES細胞和小鼠中的多重基因組編輯

　　在這里，研究人員使用CRISPR / Cas系統驅動基于NHEJ的基因破壞和基于同源定向修復（HDR）的精確基因編輯，以實現干細胞和小鼠中多個基因的高效和同時靶向。

　　參考信息：

　　http://sci-hub.tw/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643243

　　5、卵母細胞注射雄激素單倍體胚胎干細胞產生轉基因小鼠

　　單倍體細胞適合進行遺傳分析。最近通過孤雌生殖衍生小鼠單倍體胚胎干細胞（haESCs）的成功使得能夠在哺乳動物細胞中進行遺傳篩選。然而，尚未實現從這些haESC成功生成活體動物，這是將遺傳分析擴展到生物體水平所需的。

　　在這里，研究人員報告從雄激素胚泡衍生haESCs。這些稱為AG-haESC的細胞部分維持父系印記，表達經典的ESC多能性標記，并在注入二倍體胚泡后對各種組織（包括種系）有貢獻。

　　引人注目的是，將AG-haESCs注射到MII卵母細胞中可以獲得活小鼠，并且這些小鼠具有攜帶haESC的遺傳性狀并發育成為可育的成年小鼠。此外，通過同源重組的基因靶向在AG-haESC中是可行的。結果表明，AG-haESC可以用作遺傳易處理的受精劑，通過注射到卵母細胞中來產生活動物。

　　參考信息：

　　https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867412004217?via%3Dihub

　　6、Tet3 DNA雙加氧酶在卵母細胞表觀遺傳重編程中的作用

　　精子和卵子攜帶獨特的表觀遺傳修飾，通過受精后的重編程進行調整。受精卵中的父系基因組在第一次有絲分裂之前經歷活性DNA去甲基化。這種父系表觀基因組重塑的生物學意義和機制尚不清楚。

　　在這里，研究人員發現在小鼠受精卵中，5-甲基胞嘧啶（5mC）的氧化發生在父本基因組上，將5mC變為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。此外，該研究還證明雙加氧酶Tet3特別富集在雄性原核中。在來自條件性敲除小鼠的Tet3缺陷受精卵中，5mC至5hmC的父本  -基因組轉換未能發生，并且5mC的水平保持恒定。Tet3的缺乏也阻礙了父本Oct4和Nanog基因的去甲基化過程，并延遲了早期胚胎中父系衍生的Oct4轉基因的后續激活。

　　在種系中耗盡Tet3的雌性小鼠表現出嚴重降低的繁殖力，并且缺乏母體Tet3的雜合突變體后代遭受發育失敗的發生率增加。缺乏Tet3的卵母細胞似乎也具有降低從體細胞重編程注射的細胞核的能力。因此，Tet3介導的DNA羥化作用參與自然受精后合子父本DNA的表觀遺傳重編程，并且還可能有助于動物克隆過程中的體細胞核重編程。

　　參考信息：

　　https://www.nature.com/articles/nature10443