免疫組化的方法很多，新方法層出不窮，如二步法，要不斷更新，與時俱進。雖然這些方法各有其特色，但總的來說，只要應用恰當均可獲得較為滿意的結果。方法的選擇并不是影響免疫組化結果的主要因素。問題在于一個單位應常規地、固定地使用一種方法，不宜交替使用不同的方法或經常更換方法。一旦選定一種方法，應務必使其標準化，力圖使一抗、二抗、標記試劑和底物的濃度、孵育時間和濃度、緩沖液的使用程序化、規范化。
一、SP法免疫組化染色
原理
鏈霉素抗生物素蛋白（SA）是從鏈霉素中分離出的蛋白質，穿透組織的能力比ABC、PAP復合物大，反應速度快，它含有四個亞基，每個亞基都有與生物素（Biotin）連接的部位，且二者間有極強的親和力，SA的等電位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）為10，因此，SA幾乎不與組織中的內源性凝集樣物質發生非特異性結合，使用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶放大系統，即可產生低背景、高放大效果。S－P采用生物素標記的第二抗體與鏈霉素抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質素混合液來測定細胞和組織中的抗原。
基本染色方法
1、石蠟切片脫蠟至水；
2、3％H202室溫孵育5～10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性；
3、蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復，可在此步后進行）；
4、5～10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小時或4℃過夜；
5、PBS沖洗，5分鐘×3次；
6、滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1％BSA－PBS稀釋），37℃孵育10～30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10～30分鐘；
7、PBS沖洗，5分鐘×3次；
8、滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10～30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10～30分鐘；
9、PBS沖洗，5分鐘×3次；
10、顯色劑顯色（DAB或AEC）；
11、自來水充分沖洗，復染，封片。
附：冰凍切片免疫組化染色步驟
1、冰凍切片4～8um，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3次。
2、用3％過氧化氫孵育5～10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
3、PBS洗，5分鐘×2次。
4、下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟。
二、卵白素－生物素－過氧化物酶復合物法
原理
本方法是利用卵白素與生物素特有的高度親和力這一生物學特性，先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成一個復合物。具體步驟是：特異性抗體與組織中抗原結合形成抗原抗體復合物。生物素化二抗再與特異性抗體反應，然后加入ABC復合物，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物。最后DAB顯色。
基本染色方法
1、切片常規脫蠟至水；
2、PBS洗5分鐘×2次；
3、0.3％甲醇－H2O2 30分鐘，37℃；
4、PBS洗5分鐘×2次；
5、正常動物血清20分鐘，37℃；
6、適當稀釋的特異性抗體60分鐘，37℃；
7、PBS洗5分鐘×2次；
8、適當稀釋的生物素標記二抗，30分鐘，37℃；
9、PBS洗5分鐘×2次；
10、ABC復合物30－60分鐘，37℃；
11、PBS洗5分鐘×2次；
12、DAB顯色，鏡下控制；
13、蘇木素襯染、脫水、透明、中性樹膠封固。