缺血修飾性白蛋白在冠心病心肌缺血診斷中價值循證評價

急性冠脈綜各征（ACS）是由于急性心肌缺血導致的胸部不適和其它癥狀的一大類病癥，是臨床常見的心臟血管急癥，也是造成急性死亡的重要原因。心肌缺血是ACS 最常見的發病機制，臨床工作中，有相當部分癥狀隱匿而未收入院治療的病人實際是心肌缺血患者，這些漏診病人的死亡性比住院患者高1倍。因此，臨床工作者一直致力于尋找一種靈敏的心肌缺血標志物，能在ACS 早期可逆階段檢出，從而有助于急性缺血患者的正確診斷和及時治療。傳統檢查方法都不能作為診斷心肌缺血的“金標準”，盡管心肌缺血時可出現ST 段和T 波改變、局限性室壁運動異常或心肌灌注缺損，但急性胸痛患者常常缺乏以上客觀檢查征象；ECG 對于AMI 和UA 有較高的特異性，而靈敏度低于50% 。超聲心動檢查的應用因存在非缺血性室壁運動異常受到限制；核素顯象只有在損傷心肌>10g 時才可檢出，該檢查成本高，難以推廣；心肌肌鈣蛋白（cTn 、肌酸激酶同功酶MB（CK-MB） 是特異的心肌損傷標志物，但發病后4－6h 才開始升高，且可逆性缺血情況下cTn 多為陰性。近年來廣泛用于臨床的心肌損傷標志物如心肌肌鈣蛋白(cTn)、肌紅蛋白(M b) 和肌酸激酶同功酶(CK-MB) 均在心肌壞死后血中濃度才升高，不利于在ACS 早期心肌損傷可逆階段做出診斷。1999 年美國學者BarOr[1]觀察到不穩定型心絞痛和心肌梗死發作早期患者的血清白蛋白(HSA ) 轉化為缺血修飾白蛋白(IMA)。提示IMA 可用于心肌缺血的早期診斷。

IMA發現的歷史

早在1990 年，1名急診醫生發現心肌缺血發作時人血清白蛋白（Human Serum albumin，HSA） 的化學性質可能會將發生改變，并發現HSA 和過渡金屬元素如Co 、Cu 和Ni有很強的結合能力[2]；1992 年臨床研究顯示AMI 和UA 患者血清lMA 水平升高；1994 年有關MA 與IMA 的UA 關系第一ZL被申請；1997 年Iscies Tecies 公司投入資金對IMA 標志物進行商業開發；1999 年利用生化分析儀進行了白蛋白鈷結合試驗（ACB）；2000 年美國多中心臨床試驗顯示在診斷ACS 時IMA 比TnI 敏感，Bar-Or 等[1]首先報告可用此來檢查心肌缺血；2001年ACB 試驗通過ISO9001 、ISO13485 、EN46001認可，并首先在歐洲銷售；2003年2月美國FDA 批準可上市銷售。在美國此項檢測己列入醫療報銷范圍。

IMA的概念和形成機制

HSA 氨基末端序列為人類所特有，是過渡金屬包括銅、鈷和鎳離子主要的結合位點，組織缺血時釋放的產物使循環血液中的部分HSA 氨基末端結合位點改變，與金屬離子結合能力下降，這部分發生了改變的HSA 就稱為IMA 。IMA 在血液中濃度升高就提示發生了組織缺血。

冠狀動脈缺血時IMA 產生的確切機制尚不清楚, 各種觀點尚有矛盾，但已定位在HSA 氨基末端N-天門冬氨酸(Asp)-丙氨酸(Ala)-組氨酸(His) -賴氨酸(Lys) 序列的變化上。當冠脈局部血液和氧供減少，組織細胞進行無氧代謝, 代謝產物乳酸堆積，導致酸中毒，局部微環境PH值下降，致使Cu 2+ 從循環蛋白的結合位點釋放，在還原劑作用下轉化為Cu1+，Cu1+ 與氧反應生成超氧自由基, 后者岐化為過氧化氫（H2O2）和氧。H2O2可通過Fenton反應形成羥自由基，羥自由基損害HAS，使N基末段序列的2-4個氨基酸發生N乙酰化或缺失，轉化為IMA。

由于各種原因引起缺血時，局部血液灌注和供氧減少，組織細胞進行無氧代謝，消耗ATP 。同時代謝產物（如乳酸）堆積，局部微環境PH 值下降，致使（Cu2+） 從循環蛋白的金屬結合位點釋放， 在還原劑如維生素C 存在時，Cu2+ 被轉化為Cu+。后者可與氧反應生成超氧自由基在超氧化物歧化酶的作用下將其歧化為過氧化氫（H2O2） 和氧。正常情況下， H2O2 是無害的，由過氧化物酶降解成水和氧氣，而當有金屬分子存在時，H2O2 可通過Fenton 反應形成羥自由基(OH)。后者具有高度活性，導致蛋白、核酸損傷和脂質過氧化。HAS 易受OH損害，使N 末端序列的4個氨基酸發生改變，形成IMA 。有報道，缺血情況下，氨基末端被乙酰化或缺失2 個氨基酸[7，8] 轉變為IMA 。在這一過程中，游離Cu2+ 具有很高的毒性作用。游離Cu2+ 釋放后，血清白蛋白的N 端序例與其結合，迅速將其清除，當白蛋白在作用下被修辭后，結合Cu2+ 的能力減弱，Cu2+ 從結合位點釋放，再次進入OH 形成過程或與正常的白蛋白結合，這就形成一個鏈式反應，最終使IMA 在缺血后數分鐘內迅速升高。

2．Wu A H B, Morris D L, Fletcher D R, et al. Analysis of the album in cobalt binding(ACBTM) test as an adjunct to cardiac troponin I for the early detection of acute myocardial infarction[J ]. Cardiovascular Toxicology, 2001, 1(2): 147

IMA的釋放動力學

常見實驗動物如狗、豬、雞的血白蛋白結構或組成與人類不同, 體內缺血發作時觀察不到IMA 升高。人體模型通過經皮冠狀動脈腔內成形術誘導短暫心肌缺血得以實現。Bar-O r等[3]對41 例接受選擇性PTCA 患者進行研究，發現術中球囊擴張壓迫> 3min可引起短暫缺血, 而且在缺血性改變后數分鐘內即出現IMA 升高，PTCA 后6 h IMA 回復至基線，并可通過白蛋白-鈷比色法將IMA 的變化檢測到。Sinha 等[4] 對接受經皮冠狀動脈介入手術(PC I) 的19 例慢性穩定性心絞痛患者(均為單支病變，一支主要冠狀動脈狹窄大于70%，無明顯側枝循環形成) 的IMA 水平實施了動態觀察，分別于PCI前和球囊擴張后即刻從導引導管、PC I 后30 min 從股動脈鞘管采取血樣，PCI后12 h采集外周血。PCI 期間19 例患者均出現了胸痛，18 例有短暫的缺血性ST 段改變。結果顯示，PCI 后即刻IMA 中位數水平高于基線值，至少持續30min，于12h回復至基線水平。可見IMA 變化明顯早于心肌壞死標志物（cTn、CKMB和Myo）。

心臟特異性

從理論上講，心肌以外組織或器官缺血也可產生IMA ，但目前在其他組織如骨骼肌缺血和循環缺氧當時，較少觀察到IMA 升高，提示IMA 可能具有心臟特異性，但具體機制尚未完全闡明。App le 等[5] 測定了19 名馬拉松比賽參賽選手比賽前(基線)、賽后即刻(比賽結束后30min 內)，和賽后24-48 h的血漿IMA 水平。測定結果顯示，賽前有6名選手(81-91 ku/L ) IMA 水平略高于參考上限(80 ku/L)，賽后即刻全部在參考范圍之內(mean= 49 ku/L)，賽后24-48 h，所有選手顯著升高(mean=84ku/L)，其中12 名選手高于參考范圍上限(81-110 ku/L)。研究結果表明：馬拉松比賽這樣的負荷，IMA 在短期內未升高，提示白蛋白-鈷結合測定至少在短期內不受骨骼肌肉組織缺血的干擾。賽后24-48小時的IMA升高可認為是由于胃腸道缺血所致或是對骨骼肌缺血的一種延遲反應。這也提示IMA對心肌缺血的特異性具有時間限制。Roy 等[6] 觀察了外周血管病變并運動誘導骨骼肌缺血時IMA 的變化。實驗發現：所有患者踏車運動試驗達峰值時明顯下降，1h 后回到基線水平，與外周血管病變成明顯負相關(r= 20. 4，P < 0. 05)。這提示患者外周血管病變運動誘導腿缺血即刻IMA 明顯降低，并與疾病的嚴重程度相關。在IMA 作為心肌缺血的標志物時應考慮外周血管病變的影響。

IMA檢測方法

1．檢測原理：正常白蛋白以活性形式存在，加入鈷試劑后，Co2+與白蛋白N-末端結合，溶液中存在的游離Co2+濃度較低，而心肌缺血患者血清標本中含有較多的IMA，加入同等量的鈷試劑后，由于IMA 與Co2+的結合能力降低，溶液中存在較高濃度的游離Co2+，加入DTT 試劑后可與游離Co2+ 產生絡合反應，在470 nm 處測定吸光度大小，吸光度高者表示血清中存在較多的IMA。

2．檢測方法：

2.1．比色測定法：IMA 檢測是以心肌缺血可引起HSA 的蛋白-鈷結合實驗測定白蛋白與外源性Co (LL) 結合的能力間接測定IMA 含量。第一代比色測定法由Bar-O r 等[1,7] 建立，手工操作，結果以吸光度單位表示，整個測定過程僅需要12min 左右。具體測定步驟是：取待測血清200mL，加入0. 1% 氯化鈷(CoCl2·6 H2O) 水溶液50mL，混合后擱置10m in 。然后加入1.5mg/mL DTT 水溶液50mL, 2min 后再加入0. 9%NaCl 溶液1.0mL 。使用分光光度計，在470 nm 處讀取吸光度單位，空白管除不加DTT 外，余同測試管。本法批內CV 為4. 1%，批間CV 為3. 8% [3 ] 。新一代的白蛋白-鈷結合實驗由美國Ischemia Techno logies 公司生產供應, 可在Cobas M IRA PLU S 、Cobas FARA 、KoneL ab20、日立911 等多種分析儀上進行, 結果用u/mL或ku/mL 表示。本法線性范圍分別在6～186 u/mL 和14 ～200 u/mL 之間, 特異性高, Co (LL ) 與免疫球蛋白(1～ 8g/dL )、Cohn FractionIII (2～10g/dL )、a2-巨球蛋白(0. 1～ 0. 8g/dL ) 和去白蛋白血漿(1～5g/dL ) 等蛋白質未發生結合，且不受肝素(415 u/mL )、血紅蛋白(1000mg/dL )、膽紅素(600～700mg/dL ) 和三酰甘油(500～779 mg/dL ) 的影響，平均回收率為98% 。

2.2．其他檢測方法：除比色測定法外，已報道的測定白蛋白-鈷結合的方法還有液相色譜法、質譜測定法以及核磁共振等，但均不太適合臨床常規分析。

缺血性修飾白蛋白（IMA）與早期診斷心肌缺血

IMA 與傳統的心肌壞死指標不同，在心肌缺血發作后5-10 min 血中濃度即可升高，而不需發生心肌細胞的不可逆損傷，能夠輔助臨床醫生早期明確缺血的診斷，早期干預治療，改善患者的預后和減少病死率。

Bar-Or 等[3] 測定139 例急性胸痛發作4h 內到達急診科患者的IMA 水平，研究白蛋白-鈷結合實驗用于鑒別急性胸痛的意義。結果顯示，99 例心肌缺血者的吸光度單位(均數±標準差為0.519±0.086) 明顯升高，與非缺血組(0.316±0.092) 相比有統計學意義。其中缺血組中95例大于判定閾值(0.40 吸光度單位)，敏感性達96%，而非缺血組中37 例小于判定閾值(0.40 吸光度單位)，特異性92.5%。該研究表明IMA 有可能成為急性心肌缺血早期生化指標。Bhagavan 等[7] 以可疑心肌損傷就診急診科的患者為研究對象，采集了75 例心肌缺血患者和92 例非心肌缺血患者的血樣，測定其血清白蛋白-CoCl 結合能力，用ROC 曲線分析評價其診斷意義，并求最適診斷界點。結果顯示在臨界點為0.50 吸光度單位時，檢出心肌缺血的敏感性和特異性分別是88% 和94%，陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV) 分別是92% 和91%，證實IMA對ACS 的早期診斷價值。

Sinha[8] 等對208名疑似ACS 患者進行臨床研究，以評價IMA 檢測的意義并比較了IMA 、ECG 和cTnT 對ACS 的早期診斷效能。所有入選患者均在出現急性胸痛后3h 內到達醫院，入院后2h 描記ECG，采血測定IMA 和cTnT。IMA 中位數值急性冠脈綜合征(95. 4u/mL，n= 131) 與非缺血性胸痛(86. 2u/mL，n = 77)比較、UA(97. 3u/L, n=85)與非缺血性胸痛和AMI(93. 2u/L, n=46)比較均顯著升高。再次證實IMA確可用于ACS早期診斷，且可區分AMI和UA，尤其對于UAP診斷具有優勢敏感性達91%。IMA單獨用于診斷ACS的敏感性是82%，心電圖與cTnT聯合敏感性僅為65%，三者聯合敏感性達95%，心電圖與cTnT聯合診斷ACS時ROC曲線下面積為0.74，再聯合IMA是ROC曲線下面積提高至0.83。可見ACS發病早期IMA確實能夠提高傳統檢查方法的診斷效能。Sinha的結論認為IMA的應用有望改進現行的急性胸痛患者診斷策略。見表1

表1 各種心肌標志物對ACS 的診斷性能

Stejskal等[9]再次驗證了白蛋白-鈷結合試驗對ACS做出早期診斷的可能性。試驗納入98名疑似ACS患者，所有入選患者在入院即刻、2h、6小時和12小時采血測定cTnI、肌紅蛋白及白蛋白-鈷結合能力，并根據最終診斷分為ACS組與非ACS組，ACS組進一步分為AMI和非AMI組。結果顯示，在入院即刻、2小時、6小時ACS組與非ACS組比較ACB值明顯升高（即刻：0.62±0.17比0.4±0.11；2小時：0.61±0.13比？；6小時：0.58±0.16比0.45±0.1），入院12小時時ACB值不適于ACS的診斷。但ACB值不能區分AMI與非AMI這一點與先前報道不一致。