毛細管電泳與質譜聯用技術

毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）是80年代初發展起來的一種基于待分離物組份間淌度和分配行為差異而實現分離的電泳新技術。具有快速、高效、分辨率高、重復性好、易于自動化等優點。質譜分析技術（MS）是通過對樣品離子的質量和強度的測定進行定量和結構分析的一種分析方法。具有分析靈敏度高、速度快等優點。這兩種技術的聯用（CE/MS）綜合二者優點成為分析生物大分子物質的有力工具。本文對近年來CE/MS中的接口及樣品預濃縮技術作一綜述。

1 儀器結構

任何一種類型質譜儀諸如傅立葉變換離子回旋加速共振質譜（FT-ICR） 、飛行時間質譜、離子陷阱質譜和三級四極桿質譜等均可與CE聯用，但四極桿質譜與CE聯用最常見。在各種CE與質譜聯用中，區帶毛細管電泳（CZE）最常用。

其它如毛細管等電聚焦電泳、膠束電動毛細管色譜、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳等應用較少。電子噴霧離子化（Electro-sprayIonization，ESl）是質譜首選的離子源。其理由有二：ESI可用于檢測多種高質量的帶電分子；其次，從CE分離出來的分子經過接口可以直接進入質譜儀。

2 接口技術

CE末端接口是影響整個檢測的一個關鍵因素，所有CE/ESI-MS接口的目標都是為了獲得穩定的霧流（Spray-Current）和高效的離子化。

由于CE需要較高離子強度、揮發性低的緩沖液，而ESI需要相對較低的鹽濃度才能獲得好的霧化及離子化。因此接口技術必須優化，使其盡可能提供好的電子接觸，同時盡量減少對CE分離效率的影響。此外，對于每一種接口應選擇相應的緩沖液。CE/ESI-MS接口共有三種類型：同軸液體鞘流（Coaxial Liquid Sheath Flow）、無鞘接口、液體連接。

2.1 同軸液體鞘流

此種類型接口是最常見的連接CE與ESI-MS的方法。該接口是一個同心的不銹鋼毛細管套在電泳毛細管末端，鞘內充有鞘液。再在此不銹鋼套外再套一個同心的鋼套，鞘內通鞘氣。鞘液與毛細管電泳緩沖液液體在尖端混合，同時被鞘氣霧化。鞘液流量通常為每分鐘納升至數微升之間，但卻顯著高于CE流速。

由于鞘液的稀釋作用，霧流穩定性得到改善。理想的鞘液緩沖液鹽濃度應在高分離（高鹽濃度）和高霧化（低鹽濃度）間優化。由于鞘液在霧化過程中也完全蒸發，鞘液的稀釋并不顯著降低檢測靈敏度。但混合液體的體積應盡可能小，以避免譜帶展寬。

2.2 無鞘接口

該CE末端做成尖細狀以獲得穩定的電子霧化。該末端外套一同心套管，內通鞘氣。該接口難點是不易同時保持CE和ESI的電路循環。為此，在毛細管末端粘上金絲或鍍一層金，但因為金的粘著力差，易被機械的或電子的原因除掉，因而接口性能差且壽命短。近來有人改進了這一接口。他們首先在CE末端鍍上一層鎳或鎳/鉻合金，再鍍上金，使接口壽命超過100小時。另外有人用鉑或鍍金不銹鋼絲插入CE末端作為毛細管內電極，并以對苯二酚緩沖液為添加劑以抑制電化學反應產生的氣泡。此種接口相對于同軸液體鞘流接口，待分析物未被稀釋，檢測靈敏度要好一些，尤其是與微克級或納克級電子霧化源相連時。

2.3 液體連接

該接口為CE末端與一個直徑10～20μm的槽垂直相連，槽內充有CE緩沖液。與CE末端相對的槽的另一端接上ESI。此裝置優點在于可通過任意調節槽內液體流速以改善ESI效果，然而這通常是以譜帶展寬和分離效能減低為代價取得的。此外，該裝置技術難度較大，現僅見于芯片CE與MS聯用的儀器。

3 樣品預濃縮

CE由于受進樣量限制，對一些含量較低的物質檢測其靈敏度仍顯不足。因此有必要對樣品在分離前進行預濃縮。濃縮的方式有三種：在線（On-Line）預濃縮、線內（In-Line）預濃縮、線外（Off-Line）預濃縮。依據濃縮原理有兩類：基于電泳的預濃縮，主要有樣品堆積（Sample Stacking） 、場放大進樣（Field-Amplified Injection，FAI）、等速電泳進樣（Isotachophoresis，ITP）等；另一類是基于層析原理的預濃縮，主要有固相吸附層析、液相分配層析、中空纖維層析、免疫親和層析等。

3.1 樣品堆積

該技術是根據樣品塞子與電泳緩沖液導電性差異實現的。若樣品的導電性小于緩沖液，樣品塞子上的電場強度將相對高于緩沖液，樣品塞子中離子的遷移速度將大于CZE緩沖液 ；若樣品以“夾心餅干”方式進行CZE，則待分析物在電泳緩沖液中聚集濃縮。此技術可顯著增加樣品的輸出信號，約達20倍。

3.2 FAI

FAI類似于樣品堆積，也是根據分析物的遷移速度與電泳緩沖液間的差異實現的。唯一差別在于進樣步驟和聚集過程。FAI是在整個進樣過程都施加電壓，而聚集發生在用緩沖液更換樣品瓶直到CZE開始的一段時間。此技術可突破樣品堆積技術70%毛細管體積進樣量限制，可使樣品濃縮約100倍，但有進樣岐化現象。

3.3 ITP

ITP既是CE的一種電泳模式又可作為預濃縮的一種方法。用ITP進行預濃縮有兩種模式：cITP（Coupled-Capillary ITP）和tITP（Transient-ITP）。cITP是用兩根毛細管聯結起來，一根用作ITP，另一根用作CZE。cITP僅用于水溶性樣品且裝置復雜因而并不常用。tITP是一種線內方法，它用同一根毛細管既作ITP又作CZE。tITP包括兩個步驟：第一步，待分析物溶解于前導離子（LE）中（通常是氨溶液），以動力進樣方式將樣品導入毛細管中。隨后將毛細管插入尾隨電解質（TE）瓶中（通常為醋酸），施加一個大約30KV電壓在毛細管兩端，使LE、待分析物、TE向陰極移動，由于淌度的差別，待分析物被聚集在LE和和TE之間；第二步，用LE作為背景電解質（Background Electrolyte）進行CZE。此技術對蛋白質和陰、陽離子多肽均可進行分析，極具前景。

3.4 固相吸附層析

該技術有兩種方式：固相萃取（SPE）和膜預濃縮。SPE常用C2、C8 或C18作吸附劑，萃取床連接在轉移毛細管與CZE之間。樣品通過轉移毛細管進入萃取床，以電泳緩沖液沖洗樣品，隨后注入50～100nl有機修飾劑的塞子使樣品洗脫進入CZE系統，隨后進行CZE。有機修飾劑可引起樣品堆積。此法可顯著降低檢測限濃度，但使分離度減小、譜帶展寬和出現拖尾。為減少此類影響有人用Cg膜作吸附劑，進一步減少萃取床體積，取得很好效果。

3.5 液液分配層析

液液分配層析預濃縮有兩種技術：EE和SLM。EE是根據液液分配層析和電泳而實現的。它有三個步驟：第一步，將樣品溶解在非極性溶劑中（如乙酸乙酯），再將裝有LE的毛細管進樣端插入樣品瓶，以電動方式進樣，同時由于液體對流的作用，可避免大量的乙酸乙酯進入區帶毛細管；第二步，毛細管插入尾隨離子（TE）中，在電場作用下，開始發生聚集。到達穩態后，毛細管插入LE瓶中進行CZE。此法濃縮能力高達1000倍，但蛋白質容易變性和在非極性相中沉淀。SLM是一種線外預濃縮技術，它用一張浸有非極性溶劑（如十一碳烷）的聚丙烯膜，將預濃縮室隔成兩個部分，一部分為供相，為樣品進入相；另一部分為受相，作為富集相。兩相均為水溶性。通過調節二相pH，使分析物在供相中不帶電荷，進入受相則帶電荷，從而達到濃縮目的。例如對一個堿性離子化合物的濃縮，調節供相pH，使pH高達10～12，而受相pH很低（例如2～4），因而堿性離子極易以中性分子的形式透過液膜進入受相，而不易從受相擴散進入供相。

3.6 中空纖維

利用中空纖維壁能夠選擇性阻止一定分子量的物質通過的特性而達到濃縮目的。此技術將中空纖維通過Teflon管與毛細管相連接，并以電動方式進樣。由于蛋白質不能透過中空纖維壁而聚集在毛細管入口端，濃縮完成后，關掉進樣電場，接通分離電場進行CZE。該技術是在線方式，不但快速、濃縮效率高，而且可除掉一些小分子物質，如鹽類。對痕量蛋白質的檢測十分有效。

3.7 免疫親和層析

該技術將親和層析柱與毛細管直接相連，以加壓方式進樣，然后依據待分析物的性質，以小體積的有機溶劑或特殊緩沖液進行洗脫，進入CZE系統，該法進樣量可達50μl，濃縮高達100～500倍，因此有效地降低了檢測限濃度。

4 存在的問題與展望

CE/MS聯用技術大大拓寬了CE和MS本身的應用領域，但CE固有的缺陷并未克服。在DNA分離時，極高的電場強度容易使較長的DNA發生伸展改變，呈桿棒狀，降低分離效果。現有的三種類型接口均有不同程度的缺陷。如同軸液體鞘流接口，由于鞘液對CE流出物的稀釋作用而降低檢測靈敏度，鞘液的成分和濃度對CE的分離均有影響；而無鞘接口壽命太短；液體連接接口同樣存在譜帶展寬的缺陷。從現有的應用及發展趨勢看，隨著接口技術的不斷改進，芯片CE與MS聯用技術的完善，一些新的濃縮技術（例如分子印跡）等的應用，CE/MS在蛋白質組學、化學藥物研究、臨床實驗診斷以及法醫學等領域均已顯示了廣闊的前景，正成為分析工作者的重要工具之一。