測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞,如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等.取得有活性的細胞應根據不同目的,采用不同方法,考慮 (1) 細胞純度； (2) 細胞獲得量； (3) 細胞活力； (4) 使用方法的簡易程度和本室條件等.
測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞,如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等.取得有活性的細胞應根據不同目的,采用不同方法,考慮 (1) 細胞純度； (2) 細胞獲得量； (3) 細胞活力； (4) 使用方法的簡易程度和本室條件等.目前常用 Ficoll 密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞.
( 一 ) 原理 :
常用來分離人外周血單個核細胞（ PBMC ）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚蔗糖 (Ficoll)- 泛影葡胺 (Urografin)(F ／ H) 分層液. Ficoll 是蔗糖的多聚體,呈中性,犌 W 水性高,平均分子量為 400,000 ,當密度為 1.2g ／ ml 仍未超出正常生理性滲透壓 , 也不穿過生物膜.紅細胞、粒細胞比重大,離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小 于或等于分層液比重,離心后漂浮于分層液的液面上,也可有少部分細胞懸浮在分層液中.吸取分層液液面的細胞,就可從外周血中分離到單個核細胞.
( 二 )方法 :
1、在短中管中加入適量淋巴細胞分離液.
2、取肝素抗凝靜脈血與等量 Hank's 液或 RPMI1640 充分混勻,用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上,注意保持清楚的界面.水平離心 2000rpm×20 分鐘.
3、離心后管內分為三層,上層為血漿和 Hank's 液,下層主要為紅細胞和粒細胞.中層為淋巴細胞分離液,在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶 ( 如下圖 ) ,單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞.此外,還含有血小板.
4、用毛細血管插到云霧層,吸取單個核細胞.置入另一短中管中,加入５倍以上體積的 Hank's 液或 RPMI1640 , 1500rpm×10 分鐘,洗滌細胞兩次.
5、末次離心后,棄上清,加入含有 10 ％小牛血清的 RPMI1640 ,重懸細胞.取一滴細胞懸液與一滴 0.2 ％臺盼蘭染液混合,于血球計數板上,計數四個大方格內的細胞總數.
單個核細胞濃度 ( 細胞數／ 1 毫升細胞懸液 ) ＝ [4 個大方格內細胞總數 / 4 ]×104×2( 稀釋倍數 )
6、細胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色,活細胞不著色.計數 200 個淋巴細胞.計算出活細胞百分率.
活細胞百分率＝活細胞數 / 總細胞數 × 100 ％
用本法分離 PBMC ,純度在 90 ％以上,收獲率可達 80 ～ 90 ％,活細胞百分率在 95 ％以上.
( 三 ) 試劑和材料 :
比重 1.077±0.001 的聚蔗糖 - 泛影葡胺 ( 商品名為淋巴細胞分離液 ) .
Hank's 液 ( 無 Ca ２＋ 、 Mg ２＋ )
10 ％小牛血清 RPMI1640
0.2 ％臺酚蘭染色液,用生理鹽水或等滲的 PBS 配制.
肝素用 Hank's 液或生理鹽水稀釋成 500 單位／ ml ,牽 9 凝人外周血肝素用量約為 50 單位／ 1 毫升血.
短中管、毛細滴管、 1 毫升和 10 毫升刻度吸管.
無菌干燥注射器針頭.
碘酒, 75 ％酒精,無菌棉球,鑷子,橡皮止血帶.
血球計數板、顯微鏡、水平式離心機.
( 四 ) 注意事項 :
1、抽取人外周靜脈血時要注意無菌操作.
2、操作全程應盡可能短時間內完成,以免增加死細胞數.
3、用淋巴細胞分離液分離 PBMC 時,離心機轉速的增加和減少要均勻、平穩,使保持清晰的界面.
4、小鼠、兔等動物淋巴細胞比重與人不同,犛 & 配制相應密度的 Percoll 或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺.