實時熒光定量pcr結果分析

　　實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光集團，利用熒光信號來實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。

　　病原學檢測是動物疾病確診的關鍵點，而聚合酶鏈式反應（PCR）是目前病原檢測的最常用的分子生物學技術，具有高敏感性的特征。PCR技術發展已日趨完善，并在此基礎上建立了實時熒光定量PCR、套式、多重、降落PCR等技術，逐漸成為實驗室常規檢測手段。本文主要向大家介紹新希望六和動保中心目前在豬病診斷中應用較多的實時熒光定量PCR檢測技術，讓大家悉知本方法的原理及結果解讀。

　　熒光定量PCR原理

　　熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

　　以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

　　傳統的PCR進行檢測時，擴增反應后需要進行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準確定量，易造成污染出現假陽性，使其應用受到限制。實時定量PCR技術不僅實現了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點，使得熒光定量PCR逐漸取代常規PCR。

　　熒光定量PCR的分類

　　 分為核酸染料法和探針法。核酸染料法實驗設計簡單，不需要設計探針，僅需要一對引物，但是核酸染料法對雙鏈的結合并沒有特異性，容易使實驗結果出現假陽性信號。動保中心全部采用探針法，此方法只有與探針結合的片段上發生擴增才能收集到熒光信號，增加了反應的特異性；另外如果對探針的5’端采用不同的熒光標記就可以進行多重熒光定量PCR。

　　結果解讀

　　一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光信號指數擴增階段， PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。為了方便定量和比較，在實時熒光定量PCR技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。

圖1 熒光定量PCR擴增曲線 注：x-軸表示PCR循環數，y-軸表示擴增反應的熒光值，Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數，起始拷貝數越多，Ct值越小。

圖2 熒光定量PCR標準曲線 注：利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

　　動保中心常用檢測項目

　　動保中心實驗室設計了特異性的引物和TaqMan-MGB探針，建立了特異性檢測PRRSV、PRV、PEDV和CSFV等的TaqMan熒光定量 PCR檢測方法。所建立的這幾種熒光定量檢測方法特異性良好，敏感性均高于普通PCR檢測方法，可定量病原含量，同時大大提高了檢測效率（檢測時間從6小時縮短至3小時以內）。

表1 新希望六和動保中心豬病常用熒光定量PCR檢測項目

　　小結

　　應用實時熒光定量PCR方法同時輔助病原分離、序列測定等手段，能夠及時、準確的對疾病作出診斷。動保中心實驗室對檢測的方法的更新與改進持續進行，例如多重熒光定量PCR檢測方法建立等，以期更好的為養殖場服務。