當前臨床流式細胞分析的發展趨勢

流式細胞分析（Flow cytometry，FCM）是以高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的一種現代細胞分析技術，它具有如下幾個特點：

①標本只要是單細胞即可用于分析，如血液、骨髓、體液中的細胞、培養細胞等，實體組織只要經處理后制成單細胞懸液也能分析，因此，實際上所有組織細胞均可用于分析。

②極短時間內可分析大量細胞，只要標本中的細胞數量足夠，流式細胞儀（Flow cytometer）可以每秒鐘數十、數百、數千個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數可達數千、數萬乃至數百萬個。

③可同時分析單個細胞的多種特征，當同時用多種分子探針，如用不同熒光素標記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，即可獲得單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數更為準確。

④定性或定量分析細胞：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達量、Ca2+濃度、酶活性、細胞的功能等均可進行單細胞水平的定性與定量分析。

由上述幾個主要特點可知，FCM是一種在醫學基礎、臨床及科學研究中有著廣泛的應用前景的細胞分析技術，尤其是隨著人類基因組計劃完成后，流式細胞分析在單細胞水平研究基因的表達、調控及功能等也將有著更廣泛的應用。

近年來，隨著流式細胞儀性能的不斷改進和測定方法與技術的迅速發展，流式細胞儀迅速進入臨床實驗室，臨床流式細胞分析（Clinical flow cytometry）在臨床檢驗醫學中的應用范圍不斷拓寬，一些檢驗項目已成為臨床疾病診斷、治療方案選擇、預后判斷等不可缺少的內容。

當前，臨床流式細胞分析已成為檢驗醫學發展的一個熱點，其發展趨勢主要體現在以下幾個方面。

一、從相對細胞計數到絕對細胞計數

流式細胞分析最大的優點是對混合細胞群體中亞群細胞的計數，如淋巴細胞可依其表面標志的不同分為T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD19+）、NK細胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細胞又可進一步分為輔助/誘導T淋巴細胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD4-CD8+）等。

這些亞群細胞計數過去多以相對百分比表達結果，由于百分比只能代表每種細胞在混合細胞群體中所占的比例，并不能體現在單位體積血液中的絕對數量，而現在臨床一些疾病的診斷需要考慮細胞的絕對數量，如艾滋病患者的血液中輔助/誘導T細胞（CD3+CD4+CD8-）＜200個/μl，而僅有HIV感染而未發病者的＞200個/μl。

T淋巴細胞亞群的絕對計數在國外實驗室早已成為常規檢查，而國內僅有少數實驗室開展。

流式細胞絕對計數在臨床可開展的項目包括：

①淋巴細胞亞群，尤其是T淋巴細胞亞群的絕對計數。

②外周血或骨髓中造血干/祖細胞的絕對計數。

③血液中網織紅細胞的絕對計數。

④血液中血小板數量，尤其是血小板減少癥患者血小板的絕對計數，此種計數優于血細胞分析儀法，已成為血小板計數的國際推薦參考方法。此外，可能出現在血液中的其它一些稀少細胞（如內皮細胞、轉移的腫瘤細胞等）的計數，也將發展為流式細胞絕對計數。流式細胞絕對計數的開展對臨床疾病的診斷、治療等有重要意義。

二、從相對定量到絕對定量分析

細胞的多種成分如某些抗原或受體表達的流式細胞分析，以前多以平均熒光強度（MFI）或相對熒光強度（RFI）表達其含量。由于流式細胞儀每次的儀器狀況可出現差異，每個實驗室所用儀器的類型也不盡相同，以MFI或RFI表示某些細胞的抗原或受體的表達量缺乏可比性，雖然流式細胞儀有極高的熒光靈敏度，但卻無法準確應用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細胞的某些成分，定量流式細胞術（Quantitative flow cytometry，QFCM）逐漸得到發展，其定量分析原理主要有兩種：

①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數的混合微球，此微球與待測標本在相同條件下與熒光素標記的單克隆抗體（McAb）反應后在流式細胞儀上測定其熒光強度，根據微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本中陽性細胞的對數熒光強度代入方程即可求得其每個細胞上的平均抗原分子數（抗原結合位點數）。

②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同數量熒光素分子的混合微球。在流式細胞儀儀器設置相同的條件下測定此微球及待測細胞的熒光強度，根據微球上所包被的熒光素分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本陽性細胞的對數熒光強度代入方程，可求得每個細胞上的平均熒光素分子數，根據所用于樣本測定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結合的分子比例，計算每個細胞上的平均抗原分子數。單細胞的抗原或受體定量是流式細胞分析的重要進展，為研究細胞的生物學、生物化學及免疫學等性質提供了更精確的方法。例如，白血病性原始細胞的膜CD45分子表達量低于正常淋巴細胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數顯著高于靜止血小板，活化淋巴細胞的CD69分子數顯著增高，活化中性粒細胞膜CD64分子數顯著高于靜止中性粒細胞，強直性脊柱炎患者T淋巴細胞膜HLA-B27分子數明顯增高。CD8+T淋巴細胞膜CD38分子數增高是慢性HIV感染者病情發展或死亡的更有力的預后指標；AIDS治療有效后，CD8+T淋巴細胞CD38分子數降低。

三、從單色到多色熒光分析

流式細胞分析從最初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，一般只能分析單細胞的一種或兩種信息。隨著新的熒光色素分子的不斷發現，熒光標記技術的進步和流式細胞儀的多激光激發等技術的進展，多色熒光分析得到迅速發展，三色、四色甚至五色或六色熒光分析對細胞亞群的識別、細胞功能評價等更為精確。目前，淋巴細胞亞群的分析、白血病免疫表型分析均應使用至少三色熒光以上分析才更可靠。例如：輔助/誘導T淋巴細胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細胞白血病的異常淋巴細胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細胞技術發展的必然趨勢，有條件時應盡可能地采用。

四、從細胞膜成份到細胞內成份分析

流式細胞膜免疫表型分析是最重要的分析內容之一，很多細胞亞群的檢測均是以膜免疫表型為主，如T、B淋巴細胞和NK細胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對一些細胞的系列鑒定和功能狀態分析常較為困難，而細胞漿或細胞核內成份則更能反映某些細胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細胞內成分檢測技術的不斷完善，細胞內成分檢測已成為流式細胞分析的又一個熱點。例如，急性髓系白血病性原始細胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是最為準確的系列標志，急性B淋巴細胞白血病性原始細胞漿中檢測到CD79a是最為特異的系列標志；檢測T淋巴細胞胞漿內細胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達，是判斷T淋巴細胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導T淋巴細胞（Th）進一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN^-γ）、白細胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細胞內成分檢測技術與多色免疫熒光分析方法結合，可檢測不同細胞亞群合成的不同細胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細胞經誘導劑刺激后，輔助/誘導T淋巴細胞亞類—Th1細胞內有細胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN^-γ+IL-1+。