臨床微生物實驗室的質量控制

臨床微生物檢驗，在感染性疾病及相關病患的診斷治療預防及研究工作中起者越來越重要的作用，為了保障檢驗結果的準確性和可靠性，日常工作中要注意開展質量控制，包括室間質量控制和室內質量控制。

　　室間質量控制是各地實驗室之間進行質量控制的一種方式，也是上一級實驗室對各實驗室進行質量管理的手段。參加由各省臨床檢驗中心或衛生部臨床檢驗中心組織的室間質控，會遇見一些平時罕見或未見過的菌株，通過質控檢驗對它們的生長條件、菌落形態、染色、鏡下形態等有了較深的感性認識。日后工作中倘若再遇見這些菌將不再會漏檢。

　　室間質控建立在一個較好的室內質控的基礎上的，做好室內質控直接關系到日常檢驗工作的質量。室內質控主要包括幾個方面：實驗室前的質量控制、標本接種前的質量控制、培養基的質量控制、染色液及染色方法質量控制、常用儀器的質量控制、藥敏驗的質量控制、及發報告前的質量控制。

　　要想獲得可靠的檢驗結果，首先要取得一份合格的標本，所以實驗室前的質量控制是保障檢驗結果準確性的關鍵。包括標本采集時間（時機）、采集方法與運送等。采集時間一般應在發病早期，應用抗生素前或下次用藥前（血藥濃度相對較低）。呼吸道標本的采集要盡量減少上呼吸道正常菌群干擾，如采集晨痰、隨意痰要用清水漱口2～3 次后深呼吸用力咳出氣管內之痰塊直接吐于無菌器皿內，迅速蓋上器皿蓋、送檢。注意收集濃痰或粘稠液而非唾液。咽拭子、濕潤無菌生理鹽水、濕潤無菌拭子，越過舌根到達咽后壁或懸雍垂后側或咽喉部發紅、灰白色可疑假膜部位，反復涂抹數次后小心退出，隨即置于無菌試管內塞緊塞子送檢。拭子退出時注意避免接觸口腔黏膜、舌頭等部位。泌尿道標本的采集要盡量避免或減少尿道口正常菌群干擾。采集中段尿，無論男性、女性、兒童病人均應先沖洗尿道口，棄去開始排出的尿液，留取中段尿4～6 毫升于無菌試管內塞緊塞子，盡快送檢。尿量不宜太多，試管塞子與尿液不應直接接觸。留取導尿管尿要排空導尿管內陳舊尿液，接取新引出尿液4～6 毫升。倘留置尿管超過三天，尿管內難免有細菌滋生，應避免采用。血液標本的采集要嚴格采血部位的皮膚消毒及選擇恰當采血時機，最新一期中華檢驗醫學雜志（2004 年第2 期）有詳細介紹，本文從略。糞便標本的采集要挑取含膿、黏液、血等病理改變或水樣糞便送檢。直腸拭子采樣量要足夠，拭子上肉眼應可見糞便。膿液標本要盡量避免病灶表面細菌污染。開放性膿腫，采樣前無菌鹽水沖洗傷口，拭去表面污染膿液，挑取病灶深部膿液；封閉性膿液，嚴格病灶皮膚或黏膜表面的消毒后無菌干燥注射器穿刺抽取，置無菌試管內送檢，或切開排膿時無菌拭子采集深部膿液。當創面出血、或受傷12 小時、換藥2 小時內等情況不宜采集標本。為了采集到各種比較合格的臨床標本，實驗室人員平時須與臨床醫生、護士、多些溝通；與護理部聯系進行有關講座，讓護士們清楚各種標本如何留取；或制作一些正確留取標本的指南、便條、打印好，分發給臨床。

　　各種臨床標本送到實驗室后，大致檢查其是否合格，很有必要。這就是標本接種前質量控制。對呼吸道標本要了解其受正常口腔菌污染或影響程度。具體做法一是記錄標本外觀：分為膿痰（P）、粘液（M）、血（B）、唾液（S）、水樣（W）五個級別，以P、M、B 級別適合細菌培養；二是涂片鏡檢：無菌拭子挑取少量痰塊于潔凈玻片，直接鏡檢或革蘭染色后鏡檢。低倍鏡記錄白細胞、上皮細胞數量，倘白細胞＞25個、上皮細胞＜10 個，或白細胞＞＞上皮細胞數，視為合格的標本；油鏡檢查有否革蘭氏陽性、陰性細菌及數量多寡，倘有特征性表現，可先電話報告臨床。對泌尿道標本要了解尿液中各種細胞數，初步判斷有否尿路感染。具體做法取尿沉渣直接鏡檢，低倍鏡，平均5 視野，記錄白細胞、紅細胞、上皮細胞及管型等數量，記錄于檢驗單背后，對血液細菌培養標本，要記錄采血量是否足夠，即血量與增菌液量之比是否達到1：5-10。對糞便標本肉眼檢查是否有膿液、血液、黏液等病理改變的糞便或肛拭子上有否足夠的標本。

　　培養基質量控制包括3 方面。一是原料選擇：基礎培養基一定挑選優質品牌，如梅里埃產品，Oxoid等；二是配制方法，每次配制均按實驗操作手冊的方法與分量，記錄配制量與操作者、日期，并于包裝上標明使用期限。三是質量檢查，用特定菌株接種看其長勢是否符合規定，如巧克力平板接種流感嗜血桿菌；血平板接種? 溶血鏈球菌和γ溶血鏈球菌；SS平板接種痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。以保證各種培養基能培養分離出相應的致病菌，提高分離率。

　　染色液及染色方法質量控制。染色液的配置必須按標準方法與分量，過濾后使用，每次記錄配置量與操作者。還要進行染色步驟質控。如革蘭染色在一張玻片上同時涂有金葡菌和大腸桿菌；抗酸染色同時加入一張分枝桿菌的涂片，等等。以保證染色性判斷準確無誤。

　　常用儀器質量控制包括對冰箱、二氧化碳孵箱、普通孵箱、水浴箱等基本設備的每日溫度、氣體濃度的監控記錄；細菌鑒定儀、血培養儀等儀器的使用、保養、維修記錄。以保障實驗室各種設備、儀器的正常運轉。可在基本設備的箱壁貼上一張記錄表，每月或兩月一表。每日上班打開設備前先觀測記錄，倘有超出規定范圍馬上找原因，及時糾正。在儀器的旁邊置一記錄本，每次使用、保養、維修都要記下來，發生故障于尋找原因。使用細菌鑒定儀要注意維持比色的清潔，不要在比色板上方添加試劑；取、放鑒定條要小心，以免打翻溢出；比色完畢即將比色板送入機體內。定期請工程師校對比色、比濁系統，也可用標準菌株作質控對照，使用ATB 細菌鑒定儀的實驗室為了保證鑒定結果準確，可在儀器自動鑒定，后用肉眼，再核對一次。目測看看鑒定板上20～32 個生化反應的判斷是否妥當。比如肺炎克雷伯菌與陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌在ID32E 鑒定條上第3～10 組的生化反應結果多半是相同的，區別主要在第1、2、11 組，所有我們要特別留意這3 組生化反應的判斷。肺炎克雷伯菌第一組的賴氨酸陽性、鳥氨酸、精氨酸陰性，第二組的尿素酶陽性；陰溝腸桿菌鳥氨酸、精氨酸陽性，賴氨酸、尿素酶陰性；產氣腸桿菌則鳥氨酸、賴氨酸陽性、精氨酸、尿素酶陰性、且第11 組的Aspa陽性；所以鳥、精、賴、尿素及Aspa 五個關鍵生化反應的判斷一定要準確。

　　目前我國醫院的藥敏試驗都是依照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）所頒發的操作方法和判斷標準。要保證藥敏實驗結果可靠，一定要在每天的操作中嚴格執行NCCLS 的要求，如新購M-H 瓊脂要用糞腸球菌ATCC29212 復方新諾明紙片質控合格后使用；M-H 瓊脂的配置除了PH7.2～7.4；強調平板厚度4mm，用量筒分裝，9 cm 平板傾入23～25ml，一般7 日內用完，8℃儲藏，用前孵箱預溫至瓊脂表面無水滴；藥敏紙片要選購標準含量、質量穩定的產品，儲藏于-20℃以下，常用置4-8℃，用前置室溫1h 后方啟用；菌液須調至適宜濁度；標準比濁管儲藏室溫、暗處。半年更換；把菌液涂布于M-H 平板時棉拭子上多余菌液要在試管壁擠出，劃線涂布M-H 平板，旋轉平板60 度，重復涂布三次，最后拭子在平板邊緣涂布一圈；5～10 分鐘后貼藥敏紙片，無菌鑷子輕壓紙片使完全與平板表面接觸，9cm 平板貼6～7 張試紙，兩紙片中心距離≥24mm，紙片一旦貼上就不能改變位置，10～15 分鐘后倒35℃普通孵箱培養16～24 小時；讀抑菌圈要用尺子量，以沒有明顯肉眼可見生長物區域為抑菌圈，一般極細小菌落生長可忽略不計，變形桿菌抑菌圈內遷移生長的薄層菌苔、復方新諾明抑菌圈內輕微生長小于20%也可忽略不計。等等。對藥敏菌株的選擇也有明確要求，符號藥敏實驗的菌株都應選自原始的瓊脂平板，不同菌種的混合物不能在同一藥敏平板上進行實驗。避免用臨床標本直接去做藥試，倘直接做了，必須按標準方法重做第二次。此外，每周用ATCC25923 金葡、25922大腸及27853 銅綠三株標準菌株測試相應藥敏紙片看其抑菌圈是否落在NCCLS 規定范圍，檢查日常藥試結果是否可靠的周質控是必不可少的工作。倘有超出規定范圍，馬上得尋找原因糾正，或恢復每日的標準菌株質控，這時工作量很大但也無別的選擇。

　　最后，發出細菌鑒定與藥敏報告填寫驗單前還要質控，主要指兩方面把關：一是肉眼大致對照原始平板上被鑒定的細菌菌落形態與儀器或手工編碼鑒定出來的菌種是否相吻合。比如鮑曼不動桿菌由于其氧化酶陰性，常被安排上ID32 鑒定條進行鑒定，又由于其生化反應不活潑，常被細菌鑒定儀鑒定為銅綠假單胞菌，這時就要復查氧化酶實驗和對照原始板看看菌落形態到底相似鮑曼還是銅綠，核實后再填寫菌種；又如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌等常見腸桿菌科菌的菌落既有相似又有區別，在原始平板上對照一以免誤報均有必要。此外，對于呼吸道之類與外界相通的標本如被鑒定菌是條件致病菌，也須再于原始平板上最后檢視到底是否為優勢菌，是否真的需要或值得鑒定與報告，以免誤導臨床用藥。因為當初作鑒定的決定時可能會因各種細菌的長勢未充分表達而把握不準確，需要在發報告前作最后的審核。二是檢查藥敏結果與菌種是否吻合。即分析藥敏結果與鑒定出來的菌種是否一致，有無矛盾。一般來說各種細菌對抗生素的敏感性有一些比較固定的藥敏譜，每間醫院的分離菌又有一些特定的表現。比如陰溝腸桿菌對頭胞西丁多半耐藥、肺炎克雷伯菌對氨卞青霉素天然耐藥、洋蔥伯克霍爾得菌對復方新諾明、氧哌嗪青霉素、氧哌嗪青霉素/他唑巴坦等紙片的抑菌圈多半很大，對丁胺卡那、慶大霉素則多半耐藥，又比如本院的大腸埃希菌對環丙沙星的耐藥率比本地醫院的高些，等等。倘若發現藥敏譜與菌種的普遍表現有異常時，就得分析這異常到底是來自于藥敏實驗差錯或鑒定差錯，還是源自于這株菌自身產生的變異或特殊表現。這時就得把原始板與藥敏板一起對照比較，看問題到底出自那一環節，弄清楚了再填寫驗單發報告。在配置有先進細菌鑒定儀的實驗室可以通過儀器內設專家系統得到有關鑒定菌與藥敏結果的分析與提醒，這是不小的幫助，但原始板的檢查只能靠自己，在沒有先進細菌儀的醫院這最后的把關就更重要，更要靠長年累月的工作經驗和高度的責任心。最后的質控是前面所有質控效果的總體表現，也是質控的最終目的：臨床微生物實驗室發出的檢驗報告準確、可靠，對臨床醫生就有較高的診斷、治療參考價值。